【摘要】：背景與目的 正常角膜的透明性是維持良好視力的重要因素之一。當(dāng)炎癥、外傷、缺氧等因素破壞了促血管生成因子和抑制血管生成因子之間的平衡，促使血管從角膜緣長入角膜，是導(dǎo)致視力減退甚至盲目的一個主要原因。目前關(guān)于角膜新生血管(CRNV)的發(fā)病機制尚未完全闡明，生長因子、細胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)發(fā)揮的作用一直是研究關(guān)注的重點。 CC趨化因子受體3（CCR3）是一個G蛋白偶聯(lián)受體，主要表達在嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、Th2淋巴細胞、肥大細胞及巨噬細胞，其中嗜酸性粒細胞高表達。既往研究CCR3的主要功能是募集白細胞（主要是嗜酸性粒細胞和Th2細胞）至炎癥部位，參與過敏性疾病（如哮喘）的發(fā)病機制。此外，CCR3也表達于血管內(nèi)皮細胞，并參與血管生成。而且CCR3信號在脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。并參與角膜縫線法誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管的生長，但CCR3信號在角膜新生血管中的表達及具體作用機制仍不明確。 堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV是一種被普遍認可的角膜新生血管的動物模型。為了明確CCR3信號在角膜新生血管中的表達及作用機制，本課題從建立小鼠堿燒傷CRNV模型著手，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測CCR3、Eotaxin mRNA在受損角膜組織中各個時間點上的表達。應(yīng)用角膜鋪片熒光染色法和流式細胞術(shù)觀察局部應(yīng)用CCR3小分子拮抗劑SB328437進行早期干預(yù)后，對堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV形成的影響。采用Real-timePCR和Western blot法從基因水平及蛋白水平檢測并比較SB328437早期干預(yù)后角膜組織內(nèi)VEGF表達的變化，明確CCR3信號的作用機制。并應(yīng)用培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞株（HREC），通過細胞增殖實驗和管腔形成實驗，進一步證實CCR3信號在血管發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床治療新生血管性眼病提供了一定的理論依據(jù)。 研究方法 1. BALB/c小鼠60只，以堿燒傷誘導(dǎo)CRNV模型，收集堿燒傷后0d、2d、4d、7d各時間點的角膜組織，以Real-time PCR檢測堿燒傷誘導(dǎo)小鼠CRNV過程中角膜組織內(nèi)各時間點CCR3、Eotaxin mRNA的表達。 2. BALB/c小鼠60只，隨機分為實驗組和對照組。堿燒傷后立即予局部點眼干預(yù)：實驗組使用1μmol/ml CCR3拮抗劑，對照組使用0.2%透明質(zhì)酸鈉，每天3次，每次3μl，共干預(yù)1周。在角膜組織堿燒傷2周后，大體拍照初步觀察兩組角膜新生血管形成情況后處死小鼠并摘除實驗眼球，應(yīng)用角膜鋪片CD31熒光染色法檢測新生血管區(qū)域占整個角膜的面積比例，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測角膜組織中CD31陽性細胞數(shù)目，觀察CCR3拮抗劑對堿燒傷CRNV形成的影響。 3. BALB/c小鼠60只，隨機分為實驗組和對照組：干預(yù)方法同前，堿燒傷后4d，收集各組角膜組織，，應(yīng)用Real-time PCR及Western blot法從基因水平和蛋白水平檢測各組角膜組織中VEGF的表達。觀測CCR3信號通路與角膜組織內(nèi)VEGF表達的相關(guān)性。 4. HREC細胞鋪于96孔培養(yǎng)板中。隨機分為五組，分別以0.1μmol/ml，0.2μmol/ml，0.5μmol/ml，1μmol/ml的CCR3-antagonist干預(yù)，等量的PBS緩沖液作為對照。干預(yù)24h后加入CCK8細胞增殖檢測液，分光光度儀450nm波長下檢測各孔OD值。通過OD值計算和分析CCR3-antagonist對HREC細胞株增殖的影響。 5. HREC細胞鋪于含Matrigel的96孔培養(yǎng)板中，隨機分為1μmol/ml CCR3-antagonist干預(yù)組和PBS緩沖液對照組。在37℃，50ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察管腔形成情況。測定CCR3拮抗劑對HREC血管網(wǎng)形成的影響。 結(jié)果 1.堿燒傷后CCR3、Eotaxin mRNA的表達有升高趨勢，提示CCR3-Eotaxin信號參與堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管的發(fā)生發(fā)展過程。 2.局部應(yīng)用CCR3-antagonist能抑制堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV。 3. CCR3-antagonist能抑制HREC的增殖，并在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。而且CCR3-antagonist能夠抑制HREC血管網(wǎng)的形成。 結(jié)論 CCR3信號通路參與角膜新生血管的發(fā)生過程，阻斷其信號通路則抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和抑制血管網(wǎng)的形成，從而抑制新生血管的發(fā)生、發(fā)展，為臨床進一步通過干預(yù)CCR3信號通路治療新生血管性眼病提供有力的理論依據(jù)。
【圖文】：

燒傷后不同時間點角膜組織內(nèi)CCR3與EotaxinmRNA的表達

CCR3拮抗劑干預(yù)對堿燒傷誘導(dǎo)角膜新生血管形成的影響
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R772.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Inhibitory effect of CCR3 signal on alkali-induced corneal neovascularization[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2012年03期

本文編號：2540986