【摘要】：第一章青光眼小鼠模型的建立以及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞和視神經(jīng)損傷評(píng)估 目的：建立青光眼小鼠模型,觀察小鼠短期眼內(nèi)壓升高以及眼壓回復(fù)正常基線后的視神經(jīng)軸索和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷及高眼壓引起的自身免疫反應(yīng)。 方法：18只成年C57BL/6J小鼠接受單側(cè)眼前房注射15μm多苯乙烯微粒,制作單側(cè)眼短期眼壓升高模型。對(duì)照組為18只前房接受等量PBS注射的同齡C57BL/6J小鼠。分別于實(shí)驗(yàn)后2周,4周及8周后處死小鼠。免疫熒光染色和電鏡量化評(píng)估視神經(jīng)和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的損傷；視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色檢測(cè)T細(xì)胞浸潤(rùn)及補(bǔ)體的沉積；Elisa檢測(cè)外周血清中總工gG以及抗熱休克蛋白27的抗體滴度。 結(jié)果：1)眼壓變化：18只全部接受微粒注射的小鼠18只眼眼壓均上升,8天左右達(dá)到峰值,維持3周左右,之后眼壓回復(fù)正常水平。2)視神經(jīng)軸索及節(jié)細(xì)胞改變：2周時(shí)高眼壓眼對(duì)比自身對(duì)側(cè)眼中視神經(jīng)軸索數(shù)目減少18.2±3.4%；視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞減少19.3±4.9%。而2到3周當(dāng)眼內(nèi)壓回復(fù)正常水平后,高眼壓組的視神經(jīng)損傷持續(xù)產(chǎn)生。至4周和8周高眼壓眼對(duì)比自身對(duì)側(cè)眼視神經(jīng)軸索數(shù)目分別減少25.8±4.6%和32.8±2.6%；(P0.05)相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少29.9±9.2%和37.3±5.7%。(P0.05)而8周相對(duì)4周以及4周相對(duì)2周視神經(jīng)軸索與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷均有顯著差異(p0.05)。3)免疫反應(yīng)-T細(xì)胞浸潤(rùn)與補(bǔ)體及抗熱休克蛋白：在C57BL/6J高眼壓模型小鼠的視網(wǎng)膜中2周至3周左右可檢測(cè)到T細(xì)胞浸潤(rùn),T細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間窗與眼壓升高同步。同時(shí)還檢測(cè)到補(bǔ)體在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞中的沉積以及外周血循環(huán)中血清總抗體和抗熱休克蛋白27抗體的升高。 結(jié)論：前房注射微粒可成功誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠高眼壓,高眼壓狀態(tài)下出現(xiàn)相應(yīng)的視神經(jīng)軸索及節(jié)細(xì)胞損傷,在眼壓回復(fù)正常之后4到8周之內(nèi)視神經(jīng)仍然持續(xù)損傷。同時(shí)高眼壓還可以啟動(dòng)全身免疫反應(yīng),這種自身免疫反應(yīng)可能與高眼壓之后視神經(jīng)持續(xù)損傷病理相關(guān)。 第二章免疫調(diào)節(jié)在青光眼持續(xù)性視神經(jīng)及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損害中的作用 目的：通過(guò)檢測(cè)免疫缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠短期高眼壓造成的視神經(jīng)軸索以及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的損傷,探討免疫調(diào)節(jié)在青光眼視神經(jīng)損害中的作用。 方法：選擇成年免疫缺陷的RAGl-/-, BCKO和TCKO小鼠的各6只單側(cè)眼前房注射多苯乙烯微粒；對(duì)照組為相同數(shù)量的轉(zhuǎn)基因小鼠前房注射PBS。分離并選擇性轉(zhuǎn)移24只C57BL/6J高眼壓小鼠和24只PBS注射對(duì)照組小鼠的CD4+T細(xì)胞分別至至12只Ragl-/-高眼壓小鼠體內(nèi)；分別于2周及8周后處死小鼠并對(duì)比同時(shí)段處死的C57BL／6J高眼壓模型小鼠量化評(píng)估各組視神經(jīng)和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的損傷。 結(jié)果：RAGl-/-,BCKO和TCKO小鼠在誘發(fā)高眼壓后2周時(shí)視神經(jīng)軸索損傷分別為11.9±2.6%,16.6±33%,16.3±3.1%；相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷為14.7±3.5%,19.0±3.8%,18.7±5.4%。而高眼壓8周時(shí)視神經(jīng)軸索損傷分別為15.2±7.3%,23.8±6.2%,21.7±6.1%；相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷為21.3±7.0%,30.6±6.2%,25.3±6.1%。微粒注射組小鼠的CD4+T細(xì)胞較對(duì)照組可明顯促進(jìn)Ragl-/-高眼壓受體小鼠的視神經(jīng)及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的損傷(p0.05)。其視神經(jīng)軸索損傷為24.3±2.4%,相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷為23.5±3.1%.而對(duì)照組視神經(jīng)軸索損傷分別為為19.3±3.9%,相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷分別為18.5±2.7%。 結(jié)論：除Ragl-/-小鼠外,TCKO及BCKO高眼壓小鼠在2周時(shí)較C57BL/6J高眼壓小鼠均無(wú)明顯神經(jīng)保護(hù)作用。而在8周時(shí)3種免疫缺陷小鼠的視神經(jīng)及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷均顯著下降。T細(xì)胞和B細(xì)胞可能同時(shí)都涉及到青光眼高眼壓后視神經(jīng)持續(xù)損傷病理機(jī)制。而T細(xì)胞可能在其中起到了核心作用。而CD4+T細(xì)胞與青光眼高眼壓后的神經(jīng)損傷病理有直接關(guān)系。 第三章熱休克蛋白27在高眼壓青光眼持續(xù)性病理?yè)p傷中的作用 目的：探討熱休克蛋白27在青光眼高眼壓小鼠模型的持續(xù)視神經(jīng)病理?yè)p傷中的作用。 方法：分別檢測(cè)1,2,4,8周的高眼壓小鼠視網(wǎng)膜熱休克蛋白27的表達(dá)(每組6只),以及小鼠外周血清總抗體和熱休克蛋白27抗體的滴度。并通過(guò)皮下注射熱休克蛋白100μg抗原聯(lián)合同體積CFA建立熱休克蛋白27超敏小鼠模型。并使用耳緣注射抗原體內(nèi)檢測(cè)熱休克蛋白27特異性的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)以及體外使用熱休克蛋白27刺激培養(yǎng)分離的胰臟淋巴細(xì)胞,從而確定該模型的CD4+T細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。選擇性轉(zhuǎn)移12只熱休克蛋白27超敏小鼠的CD4+T細(xì)胞至6只C57BL/6J高眼壓小鼠體內(nèi),并檢測(cè)其視神經(jīng)和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的損傷。使用同等劑量的OVA蛋白聯(lián)合同體積的CFA建立OVA超敏小鼠模型,并使用12只OVA超敏小鼠的CD4+T細(xì)胞準(zhǔn)移至6只C57BL/6J高眼壓小鼠作為對(duì)照。 結(jié)果：短期眼壓升高將導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜熱休克蛋白27的表達(dá)上調(diào)。通過(guò)免疫熒光和WB均可檢測(cè)到該蛋白從眼壓上升1周內(nèi)即有明顯表達(dá),而眼壓下降之后仍然持續(xù)表達(dá)至8周。熱休克蛋白27超敏小鼠的CD4+T細(xì)胞較對(duì)照組可明顯促進(jìn)C57BL/6J高眼壓小鼠的視神經(jīng)及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的損傷(p0.05)。其視神經(jīng)軸索損傷為35.3±4.6%,相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷為34.2±5.2%。而對(duì)照組視神經(jīng)軸索損傷分別為為26.2±5.2%,相應(yīng)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷分別為27.4±1.6%。 結(jié)論：熱休克蛋白27在青光眼高眼壓視網(wǎng)膜中將持續(xù)表達(dá),其可能通過(guò)觸發(fā)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而產(chǎn)生神經(jīng)元毒性作用。熱休克蛋白27特異性致敏的CD4+T細(xì)胞對(duì)青光眼高眼壓視神經(jīng)持續(xù)損傷病理起到了重要作用。 第四章青光眼病人外周血中淋巴細(xì)胞對(duì)熱休克蛋白27的反應(yīng) 目的：探討臨床青光眼患者外周血淋巴細(xì)胞對(duì)熱休克蛋白27的反應(yīng)性。 方法：取21例臨床青光眼患者以及22例同年齡組的正常人群外周血。通過(guò)E1isa檢測(cè)抗熱休克蛋白27的抗體滴度。以及分離培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞,并通過(guò)Elispot體外檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞在定量熱休克蛋白27的刺激下產(chǎn)生IFN-γ的分泌水平。 結(jié)果：臨床青光眼患者的外周血清抗熱休克蛋白27的抗體滴度較同年齡組的正常人群顯著上升27.8±2.5%(p0.05)。青光眼病人的外周血淋巴細(xì)胞較年齡配對(duì)的正常人群在熱休克蛋白27刺激下顯示出顯著升高55.4±9.4%的IFN-γ分泌水平(p0.05)。 結(jié)論：高眼壓可以觸發(fā)全身的自身選擇性免疫反應(yīng),這種免疫反應(yīng)有可能在高眼壓過(guò)后的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的持續(xù)病理?yè)p傷機(jī)制中起到重要作用,而熱休克蛋白27可能作為誘導(dǎo)這種免疫反應(yīng)的自身抗原蛋白而成為臨床治療青光眼的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

1.2.1青光眼小鼠模型的建立2月齡大小的成年C57BL/6)小鼠分為兩組，18只接受前房注射直徑為15腳的多苯乙烯微粒，從而誘發(fā)短期的高眼壓(圖1，A，B)。圖A，為微粒注射后7天后眼球切片，可見(jiàn)微粒聚集于前房角，并堵塞小梁網(wǎng)和Schelm管。從而堵塞房水的流出通道導(dǎo)致眼內(nèi)壓的升高。圖B，，為微粒注射14天之后眼球切片，可見(jiàn)聚集于前房角的大部分微粒己排出，或被虹膜及睫狀體巨嗜細(xì)胞吞噬，機(jī)化固定。14天之后

微粒注射組(n=18)對(duì)比PBS注射組(n=6)眼內(nèi)壓從注射后第二天起即顯著升高(p>0.05)。眼壓在1到2周內(nèi)達(dá)峰，峰值約為22mlnHg。3周之后兩組眼壓值無(wú)明顯差異(p<0.05)。(圖2)一i扭el· osPhereuUeeted PBSuljeeted拜奎乳井扦盆卜共:艷O

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