【摘要】：鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是我國(guó)頭頸部高發(fā)腫瘤之一,尤其廣東、廣西、湖南、福建和江西等五省是高發(fā)區(qū)。鼻咽癌大部分為低分化鱗癌,放射治療為其首選治療。但其低分化高轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),使一部分病人在首診時(shí)就出現(xiàn)了頸淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌患者放療后死亡的主要原因。鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過(guò)程,包括腫瘤細(xì)胞粘附力下降、移動(dòng)、酶降解和血管生成等多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制目前尚不十分明確。 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象,是多細(xì)胞生物形態(tài)學(xué)發(fā)生中的一個(gè)基本生理過(guò)程,表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性喪失,遷移能力增強(qiáng),同時(shí)逐漸獲得間質(zhì)表型。EMT參與了上皮源性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,尤其在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面。因此,對(duì)EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其調(diào)控機(jī)制的研究正越來(lái)越受到人們的關(guān)注。 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一種受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, PTK),屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶超家族�？稍诙喾N上皮,間葉,神經(jīng)起源組織中表達(dá),是涉及細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的極為重要的受體信號(hào)系統(tǒng),和腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。自身磷酸化是EGFR的活性主要調(diào)節(jié)方式,EGFR通過(guò)磷酸化的酪氨酸殘基與下游底物酶反應(yīng)而傳遞信號(hào)。其下游主要的信號(hào)通路包括Ras-Raf-MEK-erk/MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和JAK/STAT信號(hào)通路等。PI3K-Akt信號(hào)通路活化是EMT發(fā)生的一個(gè)核心特征。 E-cadherin是一類介導(dǎo)同源細(xì)胞間互相粘附的鈣依賴性跨膜糖蛋白,廣泛分布于各類上皮細(xì)胞表面,在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性的維持中起重要作用,E-cadherin表達(dá)的缺失可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常,極性消失,細(xì)胞間黏附能力降低,生長(zhǎng)失控并向鄰近組織侵襲,E-cadherin的表達(dá)下調(diào)或者缺失是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵事件。 目前,同時(shí)對(duì)EMT, EGFR信號(hào)通路和E-cadherin在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制及相互關(guān)系的相關(guān)研究還未見(jiàn)有報(bào)道。本研究旨在探討EGFR信號(hào)通路是否可以通過(guò)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)調(diào)控鼻咽癌的EMT及轉(zhuǎn)移侵襲能力,并分析EGFR,活化的EGFR (p-EGFR)和E-cadherin在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。 目的 1.檢測(cè)EGFR,活化的EGFR (p-EGFR)和E-cadherin蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平,探討其與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展以及臨床病理特征的關(guān)系,為臨床上尋找鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物提供研究基礎(chǔ)； 2.檢測(cè)EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá),探討其與鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性； 3.探討EGFR信號(hào)通路是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)調(diào)控鼻咽癌的EMT及轉(zhuǎn)移侵襲能力。 方法 1.檢測(cè)EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)。取54例鼻咽癌組織標(biāo)木作為實(shí)驗(yàn)組,23例鼻咽粘膜慢性炎組織做對(duì)照組。 (1)免疫組化法研究EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白在54例鼻咽癌組織中和23例鼻咽粘膜慢性炎組織中的表達(dá)水平； (2)探討EGFR, p-EGFR和E-cadherin之間的關(guān)系及其與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。 2.探討鼻咽癌細(xì)胞系中EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白表達(dá)水平與其遷移能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系,及其三種蛋白表達(dá)水平之間的關(guān)系,為后續(xù)試驗(yàn)篩選出干預(yù)的細(xì)胞系。 采用鼻咽癌細(xì)胞系5-8F, CNE-1, CNE-2,6-10B,用以下方法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,侵襲轉(zhuǎn)移能力,EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白的表達(dá)情況。 (1)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)遷移能力； (2) Transwell:檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力； (3) Western blot:檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞系中EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白表達(dá)水平； (4)分析鼻咽癌細(xì)胞系中EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白表達(dá)水平與其運(yùn)動(dòng)遷移能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性,及其三種蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性。 3.探討EGFR信號(hào)通路對(duì)E-cadherin表達(dá)的調(diào)節(jié)和對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT的影響,以及細(xì)胞內(nèi)EGFR的表達(dá)水平與其對(duì)小分子酪氨酸激酶抑制劑Erlotinib敏感性的關(guān)系。 采用通過(guò)第二部分實(shí)驗(yàn)篩選出的高表達(dá)和低表達(dá)EGFR的鼻咽癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象。 (1)MTT法：檢測(cè)EGF(表皮生長(zhǎng)因子)和Erlotinib對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖(抑制)率,為下一步實(shí)驗(yàn)篩選出干預(yù)濃度； (2)倒置顯微鏡：觀察干預(yù)前后細(xì)胞的形態(tài)變化； (3)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：觀察干預(yù)前后細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力變化； (4) Transwell:檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化； (5) Western blot:檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞內(nèi)EGFR, p-EGFR, Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)的變化； (6) RT-PCR:檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞內(nèi)EGFR和E-cadherin mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果 1.54例鼻咽癌組織中,37例表達(dá)EGFR(68.5%),33例表達(dá)p-EGFR(61.1%),19例表達(dá)E-cadherin(35.2%)；23例鼻咽粘膜慢性炎組織中8例表達(dá)EGFR(34.8%),5例表達(dá)p-EGFR(21.7%),21例表達(dá)E-cadherin(91.3%),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析EGFR, p-EGFR和E-cadherin在兩種組織之間的表達(dá)差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)； 2. EGFR在鼻咽癌組織的表達(dá)水平與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(p0.05),與患者年齡,性別,原發(fā)灶大小,臨床分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(p0.05)；p-EGFR在鼻咽癌組織的表達(dá)水平與患者年齡,性別,原發(fā)灶大小,臨床分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(p0.05)；E-cadherin在鼻咽癌組織的表達(dá)水平與臨床分期,有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(p0.05),與患者年齡,性別,原發(fā)灶大小無(wú)關(guān)(p0.05)； 3. EGFR和p-EGFR蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)正相關(guān)(r=0.532,p0.05),和E-cadherin的表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.345,p0.05)；p-EGFR和E-cadherin的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=-0.122,p=0.380)； 4.在鼻咽癌細(xì)胞系中,5-8F的侵襲轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng),6-10B的侵襲轉(zhuǎn)移能力最弱(p0.05)；EGFR和p-EGFR在5-8F中表達(dá)水平最高,在6-10B中表達(dá)水平最低(p0.05); E-cadherin在5-8F中的表達(dá)水平最低,在6-10B中的表達(dá)水平最高(p0.05)； 5.在鼻咽癌細(xì)胞系中,EGFR和p-EGFR的表達(dá)水平與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力正相關(guān),E-cadherin的表達(dá)水平與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力負(fù)相關(guān)； 6.EGF干預(yù)鼻咽癌細(xì)胞5-8F后,細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化,遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),p-EGFR和Vimentin蛋白表達(dá)增高蛋(p0.05), E-cadherin蛋白及mRNA的表達(dá)均下調(diào)(p0.05),EGFR蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(p0.05)； 7. Erlotinib干預(yù)鼻咽癌細(xì)胞5-8F后,細(xì)胞形態(tài)向上皮表型轉(zhuǎn)化,生長(zhǎng)受抑制,遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力下降,p-EGFR和Vimentin蛋白的表達(dá)下降(p0.05),E-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)均上調(diào)(p0.05), EGFR蛋白及：mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(p0.05)； 8.EGF和Erlotinib干預(yù)鼻咽癌細(xì)胞6-10B后,細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力無(wú)顯著改變(p0.05),p-EGFR和Vimentin蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),E-cadherin蛋白及(?)nRNA的表達(dá)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),EGFR蛋白及mRNA的表達(dá)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論 1. EGFR信號(hào)通路與E-cadherin在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中分別發(fā)揮了不同的作用； 2. EGFR和E-cadherin的異常表達(dá)可能影響了NPC患者N和M分期； 3. EGFR信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)控E-cadherin的表達(dá)影響鼻咽癌細(xì)胞的EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力； 4.鼻咽癌細(xì)胞系對(duì)EGFR抑制劑的敏感性依賴于胞內(nèi)EGFR的表達(dá)水平； 5. EGFR抑制劑可通過(guò)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)影響鼻咽癌細(xì)胞EMT進(jìn)程,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2531230