【摘要】：第一部分： IGF-1在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究 目的： 研究高糖培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞(Human telomerase-immortalized corneal epithelial cells, THCE)及糖尿病大鼠角膜上皮中,高糖對創(chuàng)傷刺激的IGF-1及IGF-1R表達(dá)的影響,探討外源性IGF-1對高糖培養(yǎng)的THCE細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制,闡明IGF-1在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用。 方法： 1.根據(jù)文獻(xiàn)報道的THCE高糖干預(yù)模型,分別用5mM-45mM濃度的葡萄糖處理THCE細(xì)胞24h或48h,MTT法檢測THCE細(xì)胞存活率,篩選合適的高糖濃度及作用時間。根據(jù)文獻(xiàn)報道的外源性IGF-1干預(yù)濃度,分別用10-200ng/ml的IGF-1處理THCE細(xì)胞48h,MTT法檢測THCE細(xì)胞存活率,篩選合適的IGF-1濃度。 2.分別用5mM、25mM濃度的葡萄糖預(yù)處理THCE細(xì)胞48h,經(jīng)生長因子饑餓12h后,收集未劃傷及劃傷后不同時間點的兩組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用real-time PCR法檢測IGF-1及IGF-1R mRNA表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定IGF-1蛋白水平,western blot分析IGF-1R蛋白表達(dá),免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測IGF-1、IGF-1R蛋白分布及表達(dá)。 3.比較正常及糖尿病大鼠角膜上皮創(chuàng)傷愈合情況,研究創(chuàng)傷后角膜上皮中IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白的表達(dá)。 4.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長因子饑餓后,外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同時間點分別對5mM葡萄糖、25mmM葡萄糖、25mmM葡萄糖+IGF-1處理的三組細(xì)胞,利用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力；Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法+流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。 5.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長因子饑餓后,外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同時間點分別收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細(xì)胞,利用real-time PCR法、western blot及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測增殖、遷移及凋亡相關(guān)因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.制作高糖干預(yù)模型的合適條件為25mM濃度的葡萄糖處理THCE細(xì)胞48h。外源性添加IGF-1的合適濃度為50ng/ml。 2.在正�；蚋咛桥囵B(yǎng)的兩組THCE細(xì)胞中,劃傷可刺激IGF-1及IGF-1R mRNA表達(dá)上調(diào)；劃傷后12及24h,高糖組IGF-1及IGF-1R mRNA表達(dá)顯著低于正常組；劃傷后24及48h,高糖組IGF-1及IGF-1R蛋白表達(dá)顯著低于正常組；劃傷后48h,高糖組IGF-1及IGF-1R熒光染色強(qiáng)度低于正常組。 3.與正常大鼠相比,糖尿病大鼠角膜上皮創(chuàng)傷愈合顯著延遲。傷后1,2,3天,糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R mRNA表達(dá)顯著低于正常大鼠。傷后2,3天,糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R熒光染色強(qiáng)度低于正常大鼠。 4.高糖抑制THCE細(xì)胞存活率,下調(diào)增殖相關(guān)因子ki-67mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+IGF-1組的細(xì)胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組,與正常組無顯著差異。 5.高糖抑制THCE細(xì)胞遷移能力,下調(diào)遷移相關(guān)因子MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+IGF-1組的細(xì)胞遷移能力、MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組,與正常組無顯著差異。 6.高糖誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡,上調(diào)促凋亡因子bax mRNA及蛋白表達(dá),下調(diào)凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)。添加IGF-1可改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及bax、bcl-2表達(dá)變化,但與正常組相比,仍存在顯著差異。 結(jié)論： 在THCE細(xì)胞及糖尿病大鼠角膜上皮中,高糖抑制創(chuàng)傷刺激的IGF-1及IGF-1R表達(dá)。高糖通過抑制IGF-1表達(dá),引起ki-67、MMP-2、bcl-2表達(dá)下調(diào)、bax表達(dá)上調(diào),從而降低THCE細(xì)胞增殖、遷移,誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡,這可能是導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。 第二部分： β-catenin信號在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究 目的： 研究高糖培養(yǎng)的THCE劃傷后β-catenin信號的表達(dá),探討激活β-catenin信號對高糖培養(yǎng)的THCE細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制,闡明β-catenin信號在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用。 方法： 1.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長因子饑餓后,外源性添加β-catenin信號激活劑Licl(0.5mM)。對5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細(xì)胞,進(jìn)行劃傷刺激,于不同時間點利用real-time PCR法檢測P-catenin、 cyclinD1、c-myc mRNA表達(dá),western blot分析β-catenin、cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)。 2.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長因子饑餓后,外源性添加0.5mM Licl。于刺激后不同時間點分別對5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細(xì)胞,利用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力；Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法+流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。 3.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長因子饑餓后,外源性添加0.5mM Licl。于刺激后不同時間點分別收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細(xì)胞,利用real-time PCR法、western blot及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測增殖、遷移及凋亡相關(guān)因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.高糖抑制P-catenin cyclin D1、c-Myc mRNA及蛋白表達(dá),外源性添加Licl可上調(diào)P-catenin、cyclin D1、c-Myc mRNA及蛋白表達(dá),激活P-catenin信號。 2.高糖抑制THCE細(xì)胞存活率,下調(diào)增殖相關(guān)因子ki-67mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+Licl組的細(xì)胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組,與正常組無顯著差異。 3.高糖抑制THCE細(xì)胞遷移能力,下調(diào)遷移相關(guān)因子MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+Licl組的細(xì)胞遷移能力、MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組,但與正常組相比,仍存在差異。 4.高糖誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡,上調(diào)促凋亡因子bax mRNA及蛋白表達(dá),下調(diào)凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)。添加Lic1可改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及bax、bcl-2表達(dá)變化,但與正常組相比,存在顯著差異。 結(jié)論： 在THCE細(xì)胞中,高糖通過抑制β-catenin及下游靶基因cyclin D1、c-Myc的表達(dá),引起ki-67、MMP-2、bcl-2表達(dá)下調(diào)、bax表達(dá)上調(diào),從而降低THCE細(xì)胞增殖、遷移,誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡,這可能是導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。 第三部分： IGF-1調(diào)控β-catenin信號參與高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的研究 目的： 研究高糖培養(yǎng)的THCE劃傷后,外源性IGF-1對P-catenin信號表達(dá)的影響,明確IGF-1是否通過調(diào)控β-catenin信號共同參與高糖損害的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合。 方法： 高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長因子饑餓后,外源性添加IGF-1。對5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細(xì)胞,進(jìn)行劃傷刺激,于不同時間點利用real-time PCR法檢測P-catenin cyclin D1mRNA表達(dá),western blot分析β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 高糖抑制β-catenin、cyclin D1mRNA及蛋白表達(dá),外源性添加IGF-1可顯著上調(diào)高糖抑制的β-catenin、cyclin D1mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)論： IGF-1可調(diào)控β-catenin信號共同參與糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R772.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2531215