【摘要】：內(nèi)耳毛細胞很容易受藥物、噪音、基因缺陷等因素的影響而受到損傷,導致永久性聽力功能障礙或者前庭功能障礙。毛細胞受到損傷后,由于哺乳類動物包括人類的毛細胞自發(fā)修復和再生能力有限,而導致聽力減退或者前庭功能障礙。激活毛細胞再生,是治療聽力和前庭功能障礙的有效途徑。而在非哺乳類的脊椎動物如鳥類,在耳毒性藥物或者噪聲損傷后,內(nèi)耳感覺上皮毛細胞可以通過支持細胞的增殖、轉(zhuǎn)分化,而使毛細胞自發(fā)再生,最終替代受損的毛細胞,維持和恢復感覺上皮的功能。通常認為,內(nèi)耳毛細胞和支持細胞具有共同的前體細胞,甚至有研究者認為有些支持細胞是處于某一個特殊分化階段的毛細胞,當受到所處環(huán)境變化如損傷、基因?qū)氲鹊挠绊懞?可以繼續(xù)完成向毛細胞的分化。因此支持細胞是目前比較公認的再生毛細胞的前體細胞。所以,對非哺乳脊椎動物的內(nèi)耳感覺上皮的支持細胞增殖機制的研究,有助于進一步對哺乳動物內(nèi)耳毛細胞再生的研究。生物的細胞每時每刻都在接受來自細胞內(nèi)外的各種各樣信號,信號轉(zhuǎn)導是生命活動的一種最基本和最重要的方式。信號轉(zhuǎn)導分子的基因突變或表達調(diào)控失常、抑制信號轉(zhuǎn)導分子的功能等,都將導致細胞對外界信號反應失控,產(chǎn)生疾病。許多疾病(尤其是腫瘤)的發(fā)生和發(fā)展與細胞信號轉(zhuǎn)導異常有直接或間接的關系。很多信號通路都參與并調(diào)控內(nèi)耳的發(fā)育、感覺細胞的再生等過程;信號通路之間還存在著相互交聯(lián)(crosstalk)作用,相互之間進行傳遞和識別,信號分子間相互作用,互相調(diào)控和協(xié)調(diào)著內(nèi)耳感覺上皮上前體細胞的分裂和毛細胞的分化。感覺前體細胞可以分化成毛細胞或者支持細胞。研究并闡明相關信號通路在內(nèi)耳感覺前體細胞增殖中的作用和機制,并調(diào)控在感覺前體細胞的增殖和分化過程中起著重要作用的相關信號通路,可以為內(nèi)耳感覺前體細胞的再生提供堅實的理論基礎,同時為毛細胞再生提供理想的途徑和方法。視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(pRb)由Rbl基因編碼,Rb在感覺前體細胞的細胞周期和維持早期毛細胞和支持細胞的靜止狀態(tài)中起著重要作用。pRb的功能由磷酸化狀態(tài)調(diào)控,pRb可以通過MEK/ERK和Rb/Raf-1兩條信號通路達到磷酸化。此外,Notch和Wnt信號通路均是高度保守的信號傳導通路,廣泛存在于各種生物體內(nèi)。Notch信號通路是通過局部細胞間的相互作用控制細胞命運的一種信號通路。Notch信號通路在內(nèi)耳發(fā)育過程中不僅起著側(cè)抑制作用,在早期發(fā)育中還起著誘導增殖分化作用]。Wnt信號通路在內(nèi)耳的發(fā)育過程中主要涉及到聽板的定向分化、耳蝸管的延伸、感覺細胞的定向分化和細胞極性的調(diào)。在內(nèi)耳中,不但調(diào)控著內(nèi)耳的發(fā)育,也可以促進耳蝸的前體細胞發(fā)生增殖。且Notch信號通路和Wnt信號通路之間存在著相互交聯(lián)(crosstalk)作用。pRb在禽類胚胎期耳囊感覺上皮的發(fā)育中有著重要的作用,但是在損失后的感覺上皮中前體細胞的增殖和再生中的作用尚不清楚；并且Notch和Wnt信號通路及其相互交聯(lián)(crosstalk)在內(nèi)耳前體細胞增殖中的作用尚未知；為研究這些內(nèi)耳發(fā)育相關的信號通路在內(nèi)耳前體細胞增殖中的作用及其機制,我們研究了pRb在損失后的新生雞橢圓囊感覺上皮中的前體細胞重新進入細胞周期中的作用,以及Notch和Wnt信號通路在哺乳類動物的內(nèi)耳感覺前體細胞增殖中的作用及機制；為進一步通過調(diào)控相關信號通路,促使哺乳動物內(nèi)耳毛細胞再生提供新的途徑和方法。第一部分pRb在新生雞橢圓囊前體細胞增殖中的作用[目的] 研究pRb在損失后的新生雞感覺上皮中的前體細胞重新進入細胞周期,發(fā)生增殖中的作用,以及MEK/ERK和Raf-1-Rb兩條信號通路在pRb蛋白的磷酸化中的作用和機制。以期在損傷后的哺乳動物感覺上皮中,通過調(diào)控pRb使內(nèi)耳前體細胞重新進入細胞周期而達到毛細胞的再生奠定基礎。[方法]本研究通過體外培養(yǎng)新生雞(P0-P3)橢圓囊,用慶大霉素損傷橢圓囊感覺上皮后,給予5’-溴脫氧尿核苷(BrdU)及MEK/ERK信號通路的阻斷劑U0126：該阻斷劑可以特異性的阻斷MEK/ERK信號通路中的ERK磷酸化；和Rb/Raf-1通路的阻斷劑RRD-251：為Rb-Raf-1的分裂子,在體內(nèi)或體外呈pRb依賴性的有效的抑制血管生成和腫瘤的生長；分析研究其對橢圓囊感覺上皮前體細胞增殖的影響；分別采用realtime PCR的方法檢測細胞增殖過程中相關的重要的增殖基因、及信號通路相關基因的表達情況,及western-blot方法分析其蛋白水平的表達變化、及其磷酸化程度的改變情況。[結(jié)果] 新生雞橢圓囊感覺上皮毛細胞被慶大霉素損傷后,毛細胞大量死亡丟失,感覺前體細胞發(fā)生大量的自發(fā)再生；當給予MEK/ERK信號通路的阻斷劑U0126及Rb/Raf-1通路的阻斷劑RRD-251后,感覺前體細胞的增殖明顯減少,呈劑量依賴性；并且通路相關基因和細胞周期的相關因子基因表達量下降,及MEK/ERK和Rb/Raf-1信號通路的相關蛋白表達下降。[結(jié)論]新生雞的內(nèi)耳感覺細胞在被損傷后,前體細胞可以大量自發(fā)的再生,因此,禽類的內(nèi)耳感覺細胞是我們研究內(nèi)耳毛細胞再生的很好的模型。pRb蛋白的磷酸化在新生雞橢圓囊的感覺前體細胞的增殖中起著重要的作用,MEK/ERK信號通路和Rb/Raf-1信號通路均參與著損失后的新生雞橢圓囊感覺上皮的pRb磷酸化過程。對于pRb在損傷后的新生雞橢圓囊前體細胞增殖中的作用的研究,為在損傷后的哺乳動物感覺上皮中,通過調(diào)控pRb使內(nèi)耳前體細胞重新進入細胞周期而達到毛細胞的再生提供了新的途徑和方法。第二部分Notch和Wnt信號通路在新生小鼠內(nèi)耳前體細胞增殖中的作用[目的]研究Notch和Wnt信號通路以及兩者的相互交連作用(crosstalk),在新生小鼠內(nèi)耳前體細胞增殖及再生中的作用;為進一步通過調(diào)控Notch或/和Wnt信號通路,促使哺乳動物內(nèi)耳毛細胞再生奠定新的理論基礎和方法。[方法]取新生小鼠(P0-P3)的內(nèi)耳基底膜行體外培養(yǎng),給予EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,5-乙炔基-2'-脫氧尿苷)和Notch信號通路的γ-secretase酶抑制劑DAPT或DBZ來抑制Notch信號通路；Wnt信號通路激動劑QS11以激活Wnt/β-catenin信號通路;研究Notch和Wnt信號通路以及兩條信號通路的相互交聯(lián)在正常的以及新霉素損傷后的新生小鼠基底膜上前體細胞增殖和再生中的作用；并用real-time PCR和western-blot方法對信號通路和前體細胞周期相關基因及蛋白表達的變化情況進行檢測和分析。[結(jié)果]在新生鼠正常和損傷后的感覺上皮上,給予小劑量DAPT抑制Notch通路后,促使感覺細胞區(qū)毛細胞明顯增多,且感覺細胞區(qū)可見大量的細胞發(fā)生增殖,可見增殖性再生；單獨給予Wnt信號通路激動劑QS11,毛細胞和支持細胞無明顯改變,亦未見明顯細胞增殖。當同時給予DAPT和QS11后,促使感覺細胞區(qū)毛細胞明顯增多,可見大量的細胞發(fā)生增殖,發(fā)生增殖的細胞數(shù)量較單獨使用Notch信號通路抑制劑DAPT促進增殖的細胞數(shù)量更為明顯；對相關信號通路及內(nèi)耳感覺細胞相關基因的表達水平的改變情況進行分析顯示：小劑量γ-secretase酶抑制劑抑制Notch信號通路后,可以使其下游基因Hes1下調(diào),當同時用Wnt信號通路激動劑后,上調(diào)了Hes1的表達；單獨抑制Notch通路和同時抑制Notch并激活Wnt通路,均使Math1、c-myc-2的表達上調(diào)。并且在單獨使用DAPT或DAPT和QS11同時使用后,β-catenin蛋白的表達量均升高。[結(jié)論]小劑量的γ-secretase酶抑制劑抑制Notch信號通路后可以促進內(nèi)耳感覺前體細胞發(fā)生增殖性再生；且Wnt信號通路可以進一步協(xié)同促進抑制Notch信號通路引起的感覺前體細胞的增殖性再生；推測是由于Hes1等基因的表達上調(diào),而增強了Wnt/β-catenin信號通路的表達,進一步促進內(nèi)耳前體細胞的增殖性再生。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764

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