【摘要】：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)由于存在慢性間歇性缺氧而誘發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變,而氧化應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體多系統(tǒng)多器官發(fā)生病變,因而OSAHS近年來受到了越來越多學(xué)者的關(guān)注。已有研究顯示缺氧與腫瘤密切相關(guān),但關(guān)于OSAHS慢性間歇性缺氧所致氧化應(yīng)激與惡性腫瘤的相關(guān)性研究目前報導(dǎo)極少。本研究通過監(jiān)測OSAHS患者的氧化應(yīng)激狀態(tài),探討AOPP的測定意義；并模擬OSAHS這種特殊的缺氧模式,建立慢性間歇性缺氧的細(xì)胞模型和動物模型,觀察慢性間歇性缺氧條件下結(jié)腸癌SW480細(xì)胞和結(jié)腸癌移植瘤宿主的氧化應(yīng)激狀態(tài),探討氧化應(yīng)激水平的改變對惡性腫瘤生長增殖的影響。本研究分為三個部分：一、OSAHS患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)及AOPP的測定意義；二、間歇性缺氧時結(jié)腸癌細(xì)胞的晚期氧化蛋白產(chǎn)物的表達(dá)及其與血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1的關(guān)系；三、結(jié)腸癌SW480細(xì)胞移植瘤宿主在慢性間歇性缺氧條件下晚期氧化蛋白產(chǎn)物的表達(dá)及與機(jī)體氧化應(yīng)激水平的相關(guān)性；探討相應(yīng)氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變對腫瘤生長增殖的影響。一、OSAHS患者氧化應(yīng)激狀態(tài)及其相關(guān)影響因素1.1研究目的通過檢測OSAHS患者晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)和其它氧化應(yīng)激因子的表達(dá),探討AOPP在反映OSAHS氧化應(yīng)激水平的價值及在OSAHS病情演變中的臨床意義。1.2研究方法檢測47例OSAHS患者和48例健康對照組血漿中AOPP、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的水平并進(jìn)行比較。結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以(x±s)表示,組間的比較采用單因素方差分析,相關(guān)分析采用correlate- bivariate- pearson檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。1.3研究結(jié)果1.3.1 OSAHS患者AOPP及其它氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)與健康對照組相比,OSAHS的血漿AOPP、MDA明顯升高,P0.01,血漿SOD、GSH-PX顯著降低P0.01。OSAHS患者按病情輕重分為輕、中、重三組,其各組間血漿AOPP、MDA、SOD、GSH-PX的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.01),其中AOPP、MDA隨著病情的加重而明顯升高,GSH-PX、SOD隨著缺氧的加重而顯著降低。1.3.2 OSAHS患者其AOPP水平與其他氧化應(yīng)激因子的相關(guān)性O(shè)SAHS患者AOPP水平與SOD (r=-0.695),與GSH-PX(r=-0.367),與MDA (r=0.823)均有相關(guān)性(P均0.01),其中與MDA水平呈正相關(guān),與SOD、GSH-PX水平負(fù)相關(guān)；且其中相關(guān)系數(shù)的絕對值以MDA最大,提示AOPP與MDA的相關(guān)性最好,而與GSH-PX的相關(guān)性最小,其Pearson相關(guān)系數(shù)為一0.367,絕對值0.5。1.3.3 OSAHS患者AOPP等氧化應(yīng)激因子與各睡眠監(jiān)測指標(biāo)的相關(guān)性分析OSAHS患者AOPP、MDA、SOD、GSH-PX水平與AHI、T90%、LSaO2均具相關(guān)性,其中AOPP、MDA水平與AHI、T90%呈正相關(guān),與LSaO2負(fù)相關(guān),(P均0.01); SOD、GSH-PX水平與AHI、T90%呈負(fù)相關(guān),與LSaO2為正相關(guān)(P均0.01)。其中AOPP與反映OSAHS病情輕重的指標(biāo)AHI的相關(guān)性好(r=0.826,0.5,P值0.01)。1.4研究結(jié)論OSAHS患者隨著病情的加重體內(nèi)氧化應(yīng)激程度加重、蛋白氧化損傷程度增強,AOPP是反映OSAHS蛋白氧化損傷的早期敏感指標(biāo)。二、間歇性缺氧時結(jié)腸癌細(xì)胞的晚期氧化蛋白產(chǎn)物的表達(dá)及其與血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1的關(guān)系2.1研究目的測定間歇性缺氧時結(jié)腸癌SW480細(xì)胞晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)和其他氧化應(yīng)激指標(biāo)的水平,以及與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達(dá),探討結(jié)腸癌細(xì)胞在間歇性缺氧時其蛋白氧化損傷與氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系,及與血管生成因子的相關(guān)關(guān)系。2.2研究方法建立細(xì)胞缺氧模型,SW480細(xì)胞按缺氧條件的不同分為：間歇性缺氧組(A組)、持續(xù)性缺氧組(B組)、常氧對照組(C組)。采用ELISA法檢測AOPP和VEGF,黃嘌呤羥胺法測定超氧化物岐化酶(SOD),分光光度法測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),用免疫熒光染色方法及Western blot方法測定TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以(x±s)表示,組間的比較采用單因素方差分析,相關(guān)分析采用correlate- bivariate- pearson檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.3研究結(jié)果2.3.1不同缺氧條件下AOPP與其它氧化應(yīng)激因子的表達(dá)與對照組C組比較,A組和B組的AOPP、MDA均升高(P均0.05)；SOD、GSH-PX下降(P均0.05)。A組與B組比較時兩者的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05),間歇性缺氧較持續(xù)缺氧時AOPP、MDA明顯升高,SOD、GAH-PX顯著下降(P均0.05)。2.3.2 AOPP與其它氧化應(yīng)激因子的相關(guān)性對間歇性缺氧組的AOPP水平與其他各項氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)：AOPP與MDA (r=0.803)呈正相關(guān),與SOD (r=-0.877)為負(fù)相關(guān),P值均0.01。AOPP與GSH-PX (r=0.413)為負(fù)相關(guān),P值均0.05,無明顯相關(guān)關(guān)系。AOPP與常用的氧化應(yīng)激因子存在相關(guān)性,AOPP可反映機(jī)體氧化應(yīng)激的程度。2.3.3AOPP與血管生成因子的相關(guān)性AOPP與血管生成因子：AOPP與VEGF(r=0.868),與TGF-β1(r=0.745),P值均0.01,為正相關(guān)關(guān)系。2.4研究結(jié)論間歇性缺氧時SW480細(xì)胞的蛋白氧化損傷增強,較持續(xù)缺氧時明顯,并且與氧化應(yīng)激的程度相關(guān)。缺氧時血管生成因子VEGF和TGF-β1較常氧條件下表達(dá)上調(diào),且以間歇性缺氧時顯著,VEGF和TGF-β1的表達(dá)與AOPP相關(guān)。三、慢性間歇性缺氧時機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)及對結(jié)腸癌增殖的影響3.1研究目的研究慢性間歇性缺氧(CH)時結(jié)腸癌SW480移植瘤宿主晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)的表達(dá)及與其他氧化應(yīng)激指標(biāo)的關(guān)系,觀察CH條件下腫瘤的生長特點、血管密度的變化及相應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),轉(zhuǎn)化生長因子D1(TGFβ1)的表達(dá),探討CH所致氧化應(yīng)激對結(jié)腸癌生長增殖的影響。3.2研究方法建立慢性間歇性缺氧的動物模型,分為四組：A組：常氧無瘤組(空氣,5%CO2),B組：常氧荷瘤組,C組：缺氧無瘤組(5%O2,90%N2,5%CO2), D組：缺氧荷瘤組。測定慢性間歇性缺氧條件下人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)；機(jī)體缺氧后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞移植瘤的生長曲線、移植瘤中微血管密度變化；缺氧后機(jī)體的氧化應(yīng)激水平,血清和移植瘤VEGF、TGFβ1的表達(dá)。結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以(x±s)表示,組間的比較采用單因素方差分析,相關(guān)分析采用correlate- bivariate- pearson檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.3研究結(jié)果3.3.1 B、D兩組移植瘤的生長曲線(體積、重量)B、D兩組裸鼠的成活率以及腫瘤的成瘤率均為100%,兩組移植瘤的體積在7d及30d時均無顯著差異,P均0.05；在14d及21d時常氧B組的腫瘤體積甚至比缺氧D組大,P均0.01；但兩組腫瘤的重量存在顯著性差異,D組腫瘤明顯重于B組,P0.01。3.3.2四組裸鼠血清AOPP和8-OHdG水平測定A組為常氧條件下飼養(yǎng)未進(jìn)行腫瘤接種的對照組,B組與A組比較發(fā)現(xiàn)B組的AOPP、8-OhdG和NO升高, SOD值下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。C組和D組分別與A組比較時,C、D組AOPP、8-OhdG和NO較A組升高,SOD值下降,差異具統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。當(dāng)D組與C組進(jìn)行兩兩比較時,D組的AOPP、8-OhdG和NO較C組高,SOD較C組低,差異均具有顯著性,P0.05。3.3.3 RT-PCR法測定人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞移植瘤iNOS的表達(dá)對iNOS mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和30個PCR循環(huán),其產(chǎn)物大小為478bp,內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在同樣條件下,其產(chǎn)物為180bp,與B組(常氧荷瘤組)比較,D組(缺氧荷瘤組)iNOS mRNA表達(dá)明顯升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.3.4 移植瘤微血管密度變化慢性間歇性缺氧組(D組)其結(jié)腸癌組織中血管密度(MVD)值為(62.89-4-1.341),而常氧組中結(jié)腸癌的MVD表達(dá)水平為(48.06-0.900),二者存在顯著性差異(P0.01),表明慢性間歇性缺氧促進(jìn)結(jié)腸癌血管的形成。3.3.5四組小鼠血清中的VEGF水平及B、D兩組腫瘤組織中的VEGF表達(dá)四組小鼠血清中的VEGF比較：B組與A組比較時發(fā)現(xiàn)B組數(shù)值(1.923±0.231)雖較A組(1.865±0.307)高,但無統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。C組(3.182+0.743)、D組(3.529±0.847)均較A組升高,差異具統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。當(dāng)D組與C組進(jìn)行比較時,差異也具有顯著性,P0.01。兩組腫瘤組織中的VEGF表達(dá)：D組(42.326±9.512)較C組(50.921±11.633)明顯升高,差異具統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。3.3.6 Western blok法測定人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞移植瘤TGF-β1的表達(dá)常氧條件下結(jié)腸癌移植瘤組織有TGF-β1的表達(dá),在慢性間歇性缺氧時結(jié)腸癌移植瘤組織的TGF-β1表達(dá)明顯升高。3.4研究結(jié)論慢性間歇性缺氧時移植瘤宿主內(nèi)蛋白氧化損傷增強,AOPP升高,并且與機(jī)體的氧化應(yīng)激程度有關(guān)。慢性間歇性缺氧條件下腫瘤組織的血管密度分布增高,同時,血管生成因子VEGF和TGF-β1的表達(dá)上調(diào),并且與氧化應(yīng)激水平正相關(guān),提示慢性間歇性缺氧所致氧化應(yīng)激促進(jìn)腫瘤的生長與增殖。小結(jié)1、OSAHS患者AOPP水平升高,與機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度正相關(guān)。2、OSAHS患者AOPP水平與病情分度呈正相關(guān)；機(jī)體的抗氧化能力與OSAHS患者病情分度呈負(fù)相關(guān)。3、間歇性缺氧時SW480細(xì)胞的蛋白氧化損傷增強,較持續(xù)缺氧組明顯；且與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。4、間歇性缺氧時SW480細(xì)胞的血管生成因子VEGF和TGF-β1均表達(dá),以間歇性缺氧時顯著,二者的表達(dá)均與AOPP相關(guān)。5、慢性間歇性缺氧時腫瘤體積較常氧條件下略小,但腫瘤組織較致密,其重量較常氧時增大。6、慢性間歇性缺氧時移植瘤宿主內(nèi)其蛋白氧化損傷增強,AOPP升高；與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。7、慢性間歇性缺氧時血管生成因子VEGF和TGF-β1表達(dá)明顯高于常氧組。8、慢性間歇性缺氧條件下腫瘤血管密度較常氧條件下增大,與VEGF和TGF-β1表達(dá)水平正相關(guān)。9、慢性間歇性缺氧時移植瘤宿主的AOPP表達(dá)與血管生成因子VEGF和TGF-β1相關(guān)。創(chuàng)新點本研究通過觀察OSAHS患者的缺氧模式與氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系,模擬OSAHS的特殊缺氧模式建立了慢性間歇性缺氧的細(xì)胞模型及動物模型,深入研究人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞在細(xì)胞局部及整個機(jī)體發(fā)生間歇性缺氧時其對應(yīng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和蛋白氧化損傷情況,移植瘤的生長變化,瘤體內(nèi)血管密度的改變,以及血管生長因子VEGF和TGF-β1的表達(dá)；探討間歇性缺氧對結(jié)腸癌增殖的影響。有關(guān)慢性間歇性缺氧所致氧化應(yīng)激對結(jié)腸癌預(yù)后的影響,目前國內(nèi)外尚無報道,此研究的完成,將對闡明結(jié)腸癌生長增殖的相關(guān)機(jī)制作出重要補充,為指導(dǎo)臨床改善結(jié)腸癌患者的預(yù)后提供理論基礎(chǔ),為結(jié)腸癌患者的防治拓展新思路。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R766;R735.35
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本文編號：
2514586
