【摘要】：目的:重組表達(dá)粉塵螨的低過敏原性過敏原,為安全高效的脫敏治療服務(wù)。方法:通過大腸桿菌表達(dá)含前肽序列的粉塵螨過敏原ProDerf1,通過一系列純化步驟后,基于過敏病例血清采用ELISA方法比較重組過敏原和天然Derf1的IgE結(jié)合活性,以判斷其過敏原性強(qiáng)弱。結(jié)果:在大腸桿菌高效表達(dá)了ProDerf1并獲得了大量純化蛋白,結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示重組ProDerf1的IgE結(jié)合活性顯著降低,顯示低過敏原性。結(jié)論:經(jīng)過透析及純化等步驟后得到的重組粉塵螨過敏原ProDerf1較天然Derf1的過敏原性低,可應(yīng)用于易于標(biāo)準(zhǔn)化的安全高效的脫敏治療制劑。
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圖片說明： 2. 1　重組表達(dá)載體pET-44a/ProDer f 1的鑒定　經(jīng)PCR初步鑒定, 1 000 bp處有目的條帶擴(kuò)增出來,與目的基因921 bp一致(圖1)。用限制性內(nèi)切酶NdeI和PstI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,得到線性pET-44a質(zhì)粒和921 bp目的條帶兩個(gè)片段(圖2),進(jìn)一步證實(shí)目的基因已經(jīng)成功構(gòu)建到pET-44a載體中。測(cè)序的結(jié)果與原始序列同源性為100%,可以進(jìn)行下一步的原核表達(dá)。圖1　重組質(zhì)粒的PCR鑒定電泳M: DL 2 000 marker; 1-4:ProDerf1基因PCR產(chǎn)物.圖2　重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳M: DL 2 000marker; 1:對(duì)照pET-44a質(zhì)粒; 2-4:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物.2. 2　ProDer f 1在大腸桿菌中的表達(dá)　重組質(zhì)粒pET-44a/ProDer f1轉(zhuǎn)化大腸桿菌RosettaBlueTM后,蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示,在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為35 000出現(xiàn)了1條新的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,與預(yù)期Mr相符。經(jīng)分析表達(dá)產(chǎn)物占細(xì)菌總蛋白的30%,說明帶His標(biāo)簽的融合蛋白ProDer f1在大腸桿菌中得到了表達(dá)。2. 3　ProDer f 1的分離純化及W estern blot分析　大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白質(zhì)后
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圖片說明： 用限制性內(nèi)切酶NdeI和PstI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,得到線性pET-44a質(zhì)粒和921 bp目的條帶兩個(gè)片段(圖2),進(jìn)一步證實(shí)目的基因已經(jīng)成功構(gòu)建到pET-44a載體中。測(cè)序的結(jié)果與原始序列同源性為100%,可以進(jìn)行下一步的原核表達(dá)。圖1　重組質(zhì)粒的PCR鑒定電泳M: DL 2 000 marker; 1-4:ProDerf1基因PCR產(chǎn)物.圖2　重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳M: DL 2 000marker; 1:對(duì)照pET-44a質(zhì)粒; 2-4:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物.2. 2　ProDer f 1在大腸桿菌中的表達(dá)　重組質(zhì)粒pET-44a/ProDer f1轉(zhuǎn)化大腸桿菌RosettaBlueTM后,蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示,在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為35 000出現(xiàn)了1條新的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,與預(yù)期Mr相符。經(jīng)分析表達(dá)產(chǎn)物占細(xì)菌總蛋白的30%,說明帶His標(biāo)簽的融合蛋白ProDer f1在大腸桿菌中得到了表達(dá)。2. 3　ProDer f 1的分離純化及W estern blot分析　大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白質(zhì)后,離心收集菌體
【作者單位】： 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系;廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院過敏反應(yīng)與免疫相關(guān)疾病研究實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30771240) 國家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)課題(2009ZX08011-004B)
【分類號(hào)】：R392.8

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張敏;豬瘟疫苗的豚鼠變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：2513909