【摘要】：目的建立檢測(cè)棘阿米巴18srDNA的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR or qPCR)方法,為無(wú)創(chuàng)早期診斷棘阿米巴病提供基因診斷標(biāo)準(zhǔn)方法。方法提取分離自土壤和水中的5株棘阿米巴DNA,測(cè)序后與GenBank中搜索到的棘阿米巴67條序列進(jìn)行比對(duì),在物種保守區(qū)域設(shè)計(jì)Real-time引物和TaqMan探針,通過(guò)T克隆載體制作標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)序,建立方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定最低檢測(cè)濃度,同時(shí)用該方法檢測(cè)其他病原微生物及臨床疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)JMP5.0.1和測(cè)評(píng)軟件進(jìn)行棘阿米巴角膜炎F檢驗(yàn)和診斷測(cè)試評(píng)估。結(jié)果qPCR和培養(yǎng)法檢測(cè)180例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,陽(yáng)性率分別為(5±1)%和(2.9±1.2)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13,P0.01)。以qPCR法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品CT值為縱坐標(biāo)(Y),以標(biāo)本濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=-3.24X+40.74,R0.99。用建立的qPCR方法測(cè)定棘阿米巴18srDNA最低濃度為10拷貝/UL。用qPCR檢測(cè)其他病原微生物,結(jié)果均為陰性。通過(guò)診斷測(cè)試評(píng)估軟件比較兩種方法檢測(cè)臨床疑似病人眼分泌物結(jié)果,95%置信區(qū)間內(nèi)qPCR方法的靈敏度為100%,傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法為62.5%。結(jié)論棘阿米巴18srDNA Real-time PCR基因檢測(cè)方法具有無(wú)創(chuàng)傷性、高效、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),適用于疑似棘阿米巴角膜炎病人的篩查。
[Abstract]:Objective to establish a real-time fluorescence quantitative PCR (Real-time PCR or qPCR) with TaqMan probe for the detection of Acanthamoeba 18srDNA in order to provide a standard method for gene diagnosis of Acanthamoeba disease in the early stage of non-invasive diagnosis. Methods five strains of Acanthamoeba DNA, isolated from soil and water were sequenced and compared with 67 sequences of Acanthamoeba isolated from GenBank. Real-time primers and TaqMan probes were designed in the conserved region of the species. The standard sample was made by T clone vector and sequenced, the standard curve of the method was established, and the lowest detection concentration was determined. At the same time, the eye secretion of other pathogenic microorganisms and clinical suspected patients with acanthoamoeba keratitis was detected by this method. The experimental data were evaluated by F-test and diagnostic test of Acanthamoeba keratitis by JMP5.0.1 and evaluation software. Results the positive rates of qPCR and culture were (5 鹵1)% and (2.9 鹵1.2)%, respectively. The positive rates were (5 鹵1)% and (2.9 鹵1.2)%, respectively. The difference was statistically significant (F = 13, P0.01). The standard curve was established by qPCR method with the standard sample CT value as longitudinal coordinate (Y), and the logarithm of sample concentration as transverse coordinate (X): Ya, 3.24X 40.74, R _ (0.999). The minimum concentration of Acanthamoeba 18srDNA determined by the established qPCR method is 10 copies / UL. QPCR was used to detect other pathogenic microorganisms, and all the results were negative. The sensitivity of qPCR method was 100% in 95% confidence interval and 62.5% in traditional laboratory culture method by comparing the results of the two methods by diagnostic test and evaluation software. The sensitivity of the two methods was 100% in 95% confidence interval and 62.5% in traditional laboratory culture method. Conclusion Acanthamoeba 18srDNA Real-time PCR gene detection method is non-invasive, efficient, specific and economical, and can be used to screen patients with suspected keratitis of Acanthamoeba.
【作者單位】： 溫州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)教研室;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院檢驗(yàn)科;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬二院育英兒童醫(yī)院新生兒科;
【基金】：浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.Y2080973) 溫州市科技局項(xiàng)目(No.Y20090012)
【分類號(hào)】：R772.21

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 吳彥萍,秦桂霞;棘阿米巴角膜炎22例報(bào)告[J];哈爾濱醫(yī)藥;2005年02期

2 靳雷,井上美智子;聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)棘阿米巴角膜炎診斷的臨床應(yīng)用[J];臨床眼科雜志;2003年02期

3 李穎超;孫中華;吳欣怡;;激光共聚焦顯微鏡診斷棘阿米巴角膜炎[J];山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào);2013年01期

4 朱學(xué)軍;林秀麗;胡建章;韓曉麗;徐國(guó)興;;角膜表面鏡片術(shù)建立兔棘阿米巴角膜炎模型[J];眼科新進(jìn)展;2010年05期

5 朱學(xué)軍;鄭彩慧;韓曉麗;王曉輝;楊娟;;棘阿米巴性角膜炎22例臨床報(bào)告[J];海峽科學(xué);2007年03期

6 金秀英,羅時(shí)運(yùn),楊寶鈴,張文華,鄒洋,李彬,李遼青,王正儀;棘阿米巴角膜炎的診斷和治療探討[J];眼科研究;2000年02期

7 姬云麗;1994～2002年我國(guó)44例棘阿米巴角膜炎病例分析[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志;2004年01期

8 孫戈利;;棘阿米巴角膜炎治愈2例分析[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2007年30期

9 劉錦,朱斌良,喬磊,張?jiān)矫?劉先寧;棘阿米巴角膜炎23例臨床報(bào)告[J];中國(guó)實(shí)用眼科雜志;2002年01期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 卓志紅,張?bào)?柳建發(fā);致病性自生生活阿米巴的研究進(jìn)展[J];地方病通報(bào);2005年02期

2 車成業(yè);趙桂秋;張麗麗;;甲硝唑與護(hù)理液對(duì)棘阿米巴原蟲(chóng)體外殺傷效果的評(píng)估(英文)[J];國(guó)際眼科雜志;2008年09期

3 朱學(xué)軍;劉曉燕;蘇曉霽;徐國(guó)興;胡健章;;18S rDNA的PCR擴(kuò)增技術(shù)在棘阿米巴角膜炎臨床診斷中的應(yīng)用[J];國(guó)際眼科雜志;2009年04期

4 張巖;棘阿米巴的分型及鑒定研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊(cè);2002年04期

5 趙桂玲;彭紅娟;;棘阿米巴角膜炎1例[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年05期

6 鄒文進(jìn);梁海明;黃海;;1%環(huán)孢霉素滴眼液聯(lián)合0.02%洗必泰滴眼液治療棘阿米巴角膜炎(附1例報(bào)告)[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

7 馬亦林;;原蟲(chóng)病研究中若干相關(guān)新問(wèn)題[J];臨床內(nèi)科雜志;2006年05期

8 惠慧;邵珠民;劉騰;;紫外分光光度法測(cè)定甲硝唑滴眼液的含量[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年16期

9 張恩英,徐克繼;近10年我國(guó)棘阿米巴角膜炎的進(jìn)展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

10 車成業(yè);趙桂秋;張晶;胡麗婷;姜楠;;甲硝唑滴眼液與角膜接觸鏡多功能護(hù)理液體外對(duì)棘阿米巴原蟲(chóng)的殺傷效果[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 潘虹;Toll樣受體4介導(dǎo)角膜棘阿米巴感染炎癥反應(yīng)及低氧對(duì)其的調(diào)控作用研究[D];山東大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 王萍;MIP-2、MMP-2與TIMP-2在兔棘阿米巴性角膜炎的表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

2 王月華;土壤中分離的棘阿米巴的18s rDNA分型鑒定及大蒜素對(duì)棘阿米巴的體外殺傷作用[D];延邊大學(xué);2006年

3 張勇;硫酸聚六亞甲基胍及中間體胺基胍的合成與性能研究[D];天津大學(xué);2006年

4 金錦華;延吉市飲用水棘阿米巴污染情況的調(diào)查[D];延邊大學(xué);2007年

5 車成業(yè);MIP-2在棘阿米巴性角膜炎中的表達(dá)[D];青島大學(xué);2008年

6 劉曉燕;角膜炎棘阿米巴培養(yǎng)及18SrDNA基因分型[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

7 孫中華;激光共聚焦顯微鏡在棘阿米巴角膜炎診療中的應(yīng)用（附病例報(bào)告）[D];山東大學(xué);2012年

8 劉斐;抗真菌藥在體外對(duì)棘阿米巴殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];延邊大學(xué);2012年

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 經(jīng)寶隆;棘阿米巴角膜炎[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊(cè);1994年01期

2 劉家英,任慧;棘阿米巴人體致病株的分離、培養(yǎng)和保存[J];寄生蟲(chóng)與醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);1998年02期

3 朱淮靈,謝馳,邵英;棘阿米巴角膜炎4例臨床報(bào)告[J];臨床眼科雜志;1997年02期

4 靳雷,井上美智子;聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)棘阿米巴角膜炎診斷的臨床應(yīng)用[J];臨床眼科雜志;2003年02期

5 趙桂霞,肖鳳枝;棘阿米巴角膜炎2例[J];眼科新進(jìn)展;2001年01期

6 鄭榮領(lǐng),蔣偉新,金秀英;接觸鏡相關(guān)性棘阿米巴性角膜炎防治研究進(jìn)展[J];眼科新進(jìn)展;2001年03期

7 姜宏鈞;棘阿米巴性角膜炎1例[J];眼科新進(jìn)展;2002年04期

8 羅時(shí)運(yùn);張文華;金秀英;鄒洋;;眼棘阿米巴的分離培養(yǎng)和鑒定[J];眼科;1993年04期

9 金秀英,羅時(shí)運(yùn),楊寶鈴,張文華,鄒洋,李彬,李遼青,王正儀;棘阿米巴角膜炎的診斷和治療探討[J];眼科研究;2000年02期

10 王莉,鄧新國(guó),龐廣仁,田小莉,王翔,丁行振;家兔棘阿米巴角膜炎模型建立的組織特征和眼部表現(xiàn)[J];眼科研究;1998年04期

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃紅深，，劉濟(jì)琪;棘阿米巴角膜炎研究的新進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)用眼科雜志;1996年12期

2 張巖,孫旭光,鄧世靖,王智群,李然,羅時(shí)運(yùn),金秀英,陳威;角膜炎棘阿米巴的18S核糖體DNA基因型鑒定[J];中華眼科雜志;2004年06期

3 吳建國(guó);應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)真菌性角膜炎[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 袁永一;中國(guó)人重度—極重度耳聾分子流行病學(xué)及致病機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2007年

本文編號(hào)：2470245