【摘要】： [目的] 1.原代大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞的純化、培養(yǎng)及其鑒定。 2.探討環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase-A,cAMP-PKA)信號(hào)通路對(duì)大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞水通道蛋白5(aquaporin 5AQP5)調(diào)控機(jī)制。 3.SD大鼠變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)動(dòng)物模型的建立及其評(píng)價(jià)。 4.探討核因子kappa B(Nuclear factor kappa B NF-κB)信號(hào)通路對(duì)AQP5表達(dá)的影響。 5.探討變應(yīng)性鼻炎高分泌性的可能機(jī)制。 6.探討變應(yīng)性鼻炎時(shí)NF-κB信號(hào)通路和cAMP-PKA信號(hào)通路之間的cross-talk。 [方法] 1.采用差速貼壁法和條件限定培養(yǎng)基,純化和培養(yǎng)大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞類型并判斷其純度。 2.PKA抑制劑H89(3μM)和cAMP激活劑forskolin (1μM)干預(yù)鼻粘膜上皮細(xì)胞12h和24h。CCK-8法檢測(cè)H89和forskolin對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；免疫細(xì)胞化學(xué)染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR)及蛋白免疫印跡(western-blotting)檢測(cè)各組鼻粘膜上皮細(xì)胞AQP5和p-CREB(Ser133)的表達(dá)。 3.通過(guò)卵清蛋白(OVA)全身和局部致敏,建立大鼠變應(yīng)性鼻炎模型,Wright's染色檢測(cè)模型組鼻腔分泌物和鼻粘膜組織嗜酸性粒細(xì)胞的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)外周血IgE水平；行為學(xué)積分對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 4. NF-κB抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium, PDTC 100mg/kg/d和50mg/kg/d)干預(yù)AR大鼠,免疫組織化學(xué)、western-blotting和Real-time PCR檢測(cè)各組鼻粘膜組織NF-κBp65、p-CREB(Ser133)、AQP5、IL-1β、TNF-α及IL-6表達(dá)。 5.H89和forskolin干預(yù)AR大鼠,免疫組織化學(xué)、Real-time PCR和western-blotting檢測(cè)各組鼻粘膜組織,NF-κBp65. p-CREB(Ser133)、AQP5、IL-1β及TNF-α表達(dá)。 6. Western-blotting檢測(cè)各組鼻粘膜組織粘蛋白5AC(MUC5AC)和粘蛋白5B(MUC5B)表達(dá)。 [結(jié)果] 1.采用差速貼壁法和條件限定培養(yǎng)基,可成功純化和培養(yǎng)鼻粘膜上皮細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定鼻粘膜上皮細(xì)胞純度可達(dá)95%。 2.H89和forskolin干預(yù)對(duì)大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。H89(3μM)干預(yù)12h和24h后,p-CREB(Ser133)和AQP5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少,p-CREB(Ser133)蛋白、AQP5蛋白及AQP5mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯減少；Forskolin (1μM)干預(yù)12h和24h后,p-CREB(Ser133)和AQP5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多,p-CREB(Ser133)蛋白和AQP5蛋白及AQP5mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增多。 3.通過(guò)卵清蛋白全身和局部致敏建立SD大鼠AR模型,HE染色顯示模型組鼻粘膜組織纖毛脫落、倒伏,血管、腺體增多,Wright's染色顯示模型組嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；外周血IgE水平增高；行為學(xué)積分較對(duì)照組明顯增高。 4.與對(duì)照組相比,模型組鼻粘膜組織NF-κBp65平均光密度值和蛋白表達(dá)明顯增多,IL-1β、TNF-α及IL-6mRNA表達(dá)明顯增多,p-CREB(Serl33)平均光密度和蛋白表達(dá)減少,AQP5平均光密度值、蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)減少；PDTC (100mg/kg/d and 50mg/kg/d)干預(yù)1d、3d和5d后,NF-KBp65平均光密度值和蛋白表達(dá)較模型組減少,IL-1β、TNF-α及IL-1βmRNA表達(dá)較模型組減少,p-CREB(Ser133)平均光密度值和蛋白表達(dá)較模型組增多,AQP5平均光密度值、蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)較模型組增多。 5.H89 (5mg/kg/d)干預(yù)1d、3d和5d后,NF-κBp65平均光密度值和蛋白表達(dá)較模型組增多,IL-1β及TNF-αmRNA表達(dá)較模型組增多,p-CREB(Ser133)平均光密度和蛋白表達(dá)較模型組減少,AQP5平均光密度值、蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)較模型組減少；Forskolin (5mg/kg/d)干預(yù)1d、3d和5d后,NF-κBp65平均光密度值和蛋白表達(dá)較模型組減少,IL-1β及TNF-αmRNA表達(dá)較模型組減少,p-CREB(Ser133)平均光密度值和蛋白表達(dá)較模型組增多,AQP5平均光密度值、蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)較模型組增多。 6.模型組MUC5AC和MUC5B蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增多；PDTC(100mg/kg/d and 50mg/kg/d)干預(yù)1d，3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白較模型組減少,H89(5mg/kg/d)干預(yù)1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表達(dá)較模型組增多。Forskolin(5mg/kg/d)干預(yù)1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表達(dá)較模型組減少。 [結(jié)論] 1.采用差速貼壁純化法和條件限定培養(yǎng)基,可獲得高純度的鼻粘膜上皮細(xì)胞。 2. cAMP-PKA信號(hào)通路通過(guò)CREB絲氨酸殘基133位點(diǎn)磷酸化途徑參與了鼻粘膜上皮細(xì)胞AQP5表達(dá)調(diào)控。 3.通過(guò)全身和鼻腔局部OVA致敏,可成功建立SD大鼠變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型。 4. NF-κB信號(hào)通路可能通過(guò)抑制CREB(Ser133)磷酸化途徑或者通過(guò)NF-κBp65與p-CREB (Ser133)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CBP途徑下調(diào)AQP5表達(dá)。 5. NF-κB信號(hào)通路上調(diào)MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表達(dá),可能引起變應(yīng)性鼻炎高分泌性；AQP5的表達(dá)減少導(dǎo)致鼻腔分泌物清除或重吸收功能障礙,加速變應(yīng)性鼻炎高分泌性。 6. cAMP-PKA信號(hào)通路可抑制NF-κB信號(hào)通路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R765.21

【引證文獻(xiàn)】

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2 張敏;TLR-NF-κB信號(hào)通路在大鼠變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的作用及雷公藤多甙干預(yù)機(jī)制的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2468954