【摘要】： 背景： 腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細(xì)胞,具有正常干細(xì)胞相似的特性——自我更新的能力和多向分化的潛能,是腫瘤增殖生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。什么是腫瘤干細(xì)胞?目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞具有如下幾個特點：(1)腫瘤組織中的極少量腫瘤細(xì)胞,具有強大的致瘤,轉(zhuǎn)移和耐藥能力。(2)無限的自我更新能力,腫瘤干細(xì)胞能夠產(chǎn)生與上一代完全相同的子代細(xì)胞。(3)分化能力,腫瘤干細(xì)胞除了自我更新之外,還能夠產(chǎn)生不同表型的腫瘤細(xì)胞,能夠在體內(nèi)形成新的腫瘤。(4)具有與非致瘤細(xì)胞(non tumorigenic cells)不同的表面標(biāo)志。現(xiàn)今,人們已成功的從急性髓性白血病,多發(fā)性骨髓瘤,乳腺癌,腦腫瘤,非小細(xì)胞肺癌,黑色素瘤,前列腺癌和膀胱癌等多種類型的腫瘤患者組織中分離并培養(yǎng)出各自的腫瘤干細(xì)胞。這證明在腫瘤細(xì)胞群體中確實存在一類極少數(shù)的能使群體擴增的腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞現(xiàn)已成為腫瘤研究的熱點。目前,主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞表面膜蛋白,粘附分子及受體的差異,通過一些假想的干細(xì)胞表面標(biāo)記,如CD133、CD44等分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞。但是由于大部分的腫瘤尚缺乏特異性的表面標(biāo)記,因此腫瘤干細(xì)胞的分離純化一直是長久以來亟待解決的難題之一。 而側(cè)群(Side Population, SP)細(xì)胞作為一種不通過尋找特異性的表面標(biāo)記,利用熒光染料外排的特性來富集腫瘤干細(xì)胞,作為研究腫瘤干細(xì)胞的方法是一種理想的途徑。SP細(xì)胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外,在一步法骨髓造血干細(xì)胞分選時分離出的弱熒光信號細(xì)胞群。這群細(xì)胞在總量上只占整個骨髓細(xì)胞的0.05%,但卻富含造血重建細(xì)胞,即造血干細(xì)胞。SP細(xì)胞現(xiàn)已經(jīng)在多種正常組織被發(fā)現(xiàn),如人和小鼠的骨髓、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)等。此外,實體腫瘤標(biāo)本以及腫瘤細(xì)胞系,如胃癌,前列腺癌,肺癌,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等都可檢測分離出SP細(xì)胞。但是在Wilms瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh6中卻沒發(fā)現(xiàn)SP。研究表明,SP細(xì)胞具有自我更新,多向分化潛能和修復(fù)組織的功能,腫瘤細(xì)胞株中的SP細(xì)胞還具有強大的致瘤能力和耐藥能力,可能是腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥的根源。SP細(xì)胞高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族成員ABCG2/Bcrpl(ATP-binding cassette superfamily G member 2/breast cancer resistance protein 1),并大多同時表達(dá)有相應(yīng)干細(xì)胞的標(biāo)記分子。ABCG2/BCRP1定位于細(xì)胞膜,具有“泵”的功能,因此SP細(xì)胞可將許多細(xì)胞毒化療藥物排出細(xì)胞外,從而使腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加ABCG-2/BCRP-1的表達(dá)可以使SP數(shù)量明顯增加。接種免疫雙缺陷品系的NOD/SCID鼠后顯示,SP細(xì)胞具有極強的成瘤能力。目前來說,在缺乏顯著的干細(xì)胞分子標(biāo)記的情況下,SP細(xì)胞可作為研究腫瘤干細(xì)胞的一種重要途徑。 本課題利用實驗室現(xiàn)有的FACS Aria的流式細(xì)胞儀,檢測鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中是否存在SP細(xì)胞亞群?如存在,SP與一些干細(xì)胞表面標(biāo)記物之間的相互關(guān)系,并在體內(nèi)外鑒定其生物學(xué)功能,分析其是否具有腫瘤干細(xì)胞的特性,并在臨床標(biāo)本中得到進(jìn)一步驗證。建立一個檢測和分離鼻咽癌干細(xì)胞的方法和平臺,為繼續(xù)深入探討鼻咽癌的病因、發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等奠定基礎(chǔ)。 方法： 一.鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中SP細(xì)胞染色條件的優(yōu)化熒光染料Hoechst33342孵育不同的時間和終濃度,利用流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡共同分析,探討獲得SP細(xì)胞所需熒光染料Hoechst33342孵育的最佳時間和最合適的終濃度。研究細(xì)胞生長密度,孵育環(huán)境對SP細(xì)胞比例的影響。 二.流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞中ABCG2, CD133的表達(dá),分析SP細(xì)胞與各表面標(biāo)記物之間的相互關(guān)系 熒光標(biāo)記的抗體PE-ABCG2, CD133與熒光染料Hoechst33342共同染色,流式細(xì)胞儀分析幾者之間的關(guān)系。 三.細(xì)胞的分選和純度鑒定利用流式細(xì)胞儀分選SP和MP細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀對所分選的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定。 四.Real-time PCR檢測SP細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族,干性相關(guān)等基因的表達(dá)流式細(xì)胞儀分選出SP和MP細(xì)胞,抽提RNA,跑膠鑒定RNA的純度和濃度,選取質(zhì)量好的RNA, qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)。 五.SP細(xì)胞的生物學(xué)功能分析 1.通過平板克隆形成試驗,MTT檢測生長曲線法比較SP和MP細(xì)胞體外的自我更新與自我增殖能力。同時,MTT檢測比較SP和MP細(xì)胞耐藥能力。 2.分化潛能的測定：分選出SP和MP細(xì)胞體外培養(yǎng)段時間后,重新Hoechst33342熒光染料染色,流式細(xì)胞儀分析SP細(xì)胞亞群比例的變化。 3. Boy den小室侵襲試驗及Transwell體外遷移試驗分析SP細(xì)胞亞群的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。 4.流式細(xì)胞儀分析SP和MP細(xì)胞的細(xì)胞周期。 5.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗：不同數(shù)量的SP和MP細(xì)胞梯度2×105,1×105,1×104和5000個皮下種植裸鼠,4W后觀察成瘤率。瘤組織HE染色,鏡下觀察結(jié)果。 結(jié)果： 一.鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中SP細(xì)胞染色條件的優(yōu)化 1.熒光染料Hoechst33342孵育時間影響5-8F中SP細(xì)胞的檢測 Hoechst33342孵育時間為70min, SP細(xì)胞染色效果較佳。 2.不同終濃度熒光染料Hoechst33342影響5-8F中SP細(xì)胞的檢測Hoechst33342孵育的合適終濃度為3mg/L。 3.不同細(xì)胞接種密度影響SP細(xì)胞的比例 不同的細(xì)胞密度或者細(xì)胞融合度會影響SP細(xì)胞的比例。在一定的程度上,細(xì)胞的接種密度降低,其側(cè)群細(xì)胞的比例也會相應(yīng)的隨之降低。相對于長滿瓶底為100%的細(xì)胞,長滿僅為70%的細(xì)胞,其SP細(xì)胞的比例降低,從2.3%降為0.8%。其都可以被Verapamil所抑制。 4.不同孵育環(huán)境影響SP細(xì)胞的比例 37℃恒溫孵箱中較之恒溫水浴箱中,SP細(xì)胞比例明顯增高�？赡芊跸渲蟹跤龑�(dǎo)致SP染色不完全。 二.流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞中ABCG2, CD 133的表達(dá),分析SP細(xì)胞與各表面標(biāo)記物之間的相互關(guān)系 SP細(xì)胞中高表達(dá)ABCG2蛋白,表達(dá)量占85.5%,而MP細(xì)胞表達(dá)僅為9.2%,即ABCG2蛋白富集表達(dá)與SP細(xì)胞中,SP表型與ABCG2的表達(dá)密切相關(guān)。而CD133蛋白,SP和MP細(xì)胞中的表達(dá)并沒有顯著性差異。SP細(xì)胞沒有富集表達(dá)CD133。 三.細(xì)胞的分選和純度鑒定 選擇終濃度為3mg/L的熒光染料Hoechst33342孵育70min,圈出SP和MP細(xì)胞門,流式細(xì)胞儀分選出SP和MP細(xì)胞。 1.倒置熒光顯微鏡鏡下觀察鏡下觀察MP細(xì)胞胞核被染色呈現(xiàn)較強藍(lán)色熒光,SP細(xì)胞胞核藍(lán)光較弱,應(yīng)為拒染或淡染的細(xì)胞。(UV激發(fā)) 2.重新上流式細(xì)胞儀檢測,分析純度達(dá)到98%以上。 四.Real-time PCR檢測SP細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族,干性相關(guān)等基因的表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因OCT4 (t=-8.242, P=0.001), SOX2 (t=-3.560, P=0.024), BMI1 (t=-5.049, P=0.007), Klf4 (t=-5.479, P=0.005), C-Myc (t=-4.283,P=0.013)等在SP細(xì)胞中表達(dá)均高于MP細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員ABCG2 (t=-12.775, P=0.000), MDR1 (t=-6.366, P=0.003), ABCC2(t=-6.058, P=0.004) SP細(xì)胞亦高表達(dá),但ABCA5 (t=-2.838, P=0.098)兩者的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)意義。膜表面標(biāo)記物CD44, SP細(xì)胞較MP細(xì)胞高表達(dá),具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-5.860, P=0.004),但兩種細(xì)胞中CD133的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.037,P=0.358) 五.SP細(xì)胞的生物學(xué)功能分析 流式細(xì)胞儀分選出SP和MP細(xì)胞,體外生物學(xué)實驗檢測其增殖、更新、遷移和分化潛能,體內(nèi)裸鼠成瘤試驗檢測其致瘤能力。 1.采用MTT法與平板克隆形成試驗檢測SP細(xì)胞的體外增殖情況,MTT法同時檢測SP細(xì)胞耐藥情況 MTT生長曲線結(jié)果提示：與MP細(xì)胞相比,SP細(xì)胞的增殖能力明顯增強,兩者具有顯著性差異(F=683.216,P=0.000)。 平板克隆形成實驗結(jié)果提示： SP細(xì)胞體外培養(yǎng)其克隆形成率(49.111±2.912)%明顯多于MP細(xì)胞(23.111±2.009)%,兩者具有顯著性差異(t=12.729, P=0.000)。與MP細(xì)胞相比,SP細(xì)胞體外自我更新,增殖能力更強。 MTT耐藥曲線結(jié)果提示： SP細(xì)胞較MP細(xì)胞耐藥性更強(F=362.120, P=0.000),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。SP細(xì)胞的IC50=0.104±0.011,MP細(xì)胞的IC50=0.051±0.006,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.078, P=0.000)。 2.分化潛能實驗 流式細(xì)胞儀分選后的SP和MP細(xì)胞,10%PAA小牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡下(UV激發(fā))：98%以上的SP細(xì)胞胞胞核藍(lán)光較弱,應(yīng)為拒染或淡染的細(xì)胞,MP細(xì)胞胞核被染色呈現(xiàn)較強藍(lán)色熒光。體外培養(yǎng)6天后,重新上流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞的比例。 SP細(xì)胞培養(yǎng)6天后,其側(cè)群比例由98%降為1%,提示大部分的SP細(xì)胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境下分化成為NSP細(xì)胞。MP細(xì)胞培養(yǎng)6天后,其側(cè)群比例為0.1%,提示可能是上次分選時SP細(xì)胞的污染。 3.體外侵襲和遷移能力 Transwell遷移實驗：細(xì)胞培養(yǎng)16小時后,SP細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)(94.000±9.615)明顯多于MP細(xì)胞(19.200±5.263),兩者具有顯著性差異(t=15.826, P=0.000)。 Boyden小室侵襲實驗：細(xì)胞培養(yǎng)48小時后,SP細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)(302.200±15.271)明顯多于MP細(xì)胞(187.400±6.914),兩者差異具有顯著性(t=15.313, P=0.000)。 提示：SP細(xì)胞侵襲運動能力較MP細(xì)胞強,與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。 4.細(xì)胞周期 流式細(xì)胞儀(BD Calibur)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,SP細(xì)胞Go/G1期細(xì)胞(62.900±2.800)%較MP細(xì)胞(54.600±2.551)%比例多,差異具有顯著性(t=3.795,P=0.019)。S期細(xì)胞數(shù)目比例SP細(xì)胞為(29.933±0.702)%,MP細(xì)胞為(29.867±0.702)%,兩者沒有統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.116,P=0.913),G2/M期細(xì)胞MP細(xì)胞(15.500±3.305)%較SP細(xì)胞比例(7.167±2.101)%多,差異有顯著性(t=-3.686,P=0.021)。SP細(xì)胞增殖指數(shù)PI=39.9%,MP細(xì)胞增殖指數(shù)PI=47.9%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.795,P=0.019)。提示：SP細(xì)胞是一類多處于G0/G1期的細(xì)胞,推測其可能是一種處于相對靜息期狀態(tài)的細(xì)胞。 5.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗 注射細(xì)胞總數(shù)分別為2×105,1×105,1×104和5000個SP細(xì)胞觀察4W,均可見瘤體形成,成瘤所需要的最低細(xì)胞數(shù)僅為5000個。而MP細(xì)胞注射細(xì)胞數(shù)目1×104和5000個,觀察4W均未見瘤體形成,注射2×105細(xì)胞才可見腫瘤形成。提示SP細(xì)胞較MP細(xì)胞有更強大的致瘤能力。 結(jié)論： 一.鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中SP細(xì)胞所需熒光染料Hoechst33342最佳的9孵育時間為70 min,最合適的孵育濃度為3mg/L。SP亞群比例為2.3%。不同的孵育環(huán)境影響SP的檢測。一定程度上,SP細(xì)胞的比例呈密度依賴。 二.流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡鑒定,分選SP和MP細(xì)胞的純度達(dá)到98%以上,為進(jìn)一步研究SP細(xì)胞提供生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 三.SP和MP細(xì)胞體內(nèi)外功能試驗具有明顯的差異。SP細(xì)胞是一類處于相對靜息期的細(xì)胞,體外培養(yǎng)具有自我更新,自我增殖和多向分化潛能,以及強大的致瘤和侵襲,轉(zhuǎn)移能力。具有腫瘤干細(xì)胞樣特性。 四.SP細(xì)胞富集表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因。高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員ABCG2等,與腫瘤耐藥性密切相關(guān)。 五.已證實的其他腫瘤的表面標(biāo)記物卻并未富集在SP細(xì)胞中,推測膜表面蛋白CD133可能并不是鼻咽癌的干細(xì)胞標(biāo)記物。其機理有待進(jìn)一步探討。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【共引文獻(xiàn)】

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1 王震龍;小腸粘膜邊緣群細(xì)胞治療大鼠短腸綜合征的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

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本文編號：2457559