【摘要】：Orexin (又稱為hypocretin)是一類神經(jīng)活性肽,包括orexin-A(hypocretin-1)和orexin-B (hypocretin-2),它們分別含有33和28個(gè)氨基酸殘基,由共同前體prepro-orexin經(jīng)水解產(chǎn)生。Orexin通過與質(zhì)膜上G蛋白偶聯(lián)的特異性受體：orexin-1型受體(OXiR)和orexin-2型受體(OX2R)結(jié)合而發(fā)揮作用。在腦中,產(chǎn)生和分泌orexin的神經(jīng)元特異地分布于下丘腦側(cè)后部,并廣泛投射至全腦。Orexin參與多種生理作用的調(diào)控,例如睡眠／覺醒、晝夜節(jié)律、神經(jīng)元的放電、攝食行為等。然而,對(duì)這種調(diào)節(jié)肽在視網(wǎng)膜中的研究卻基本上屬于空白。唯一的工作顯示,人的視網(wǎng)膜神經(jīng)元表達(dá)orexin-A和orexin-B,但作者并未用免疫熒光雙標(biāo)檢測這些神經(jīng)元的細(xì)胞類型。本工作中,我們首先研究了orexin及其受體在大鼠視網(wǎng)膜各類細(xì)胞上的分布；并進(jìn)一步研究了orexin-A對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ganglion cell, GC)上L型鈣電流的調(diào)制作用及其機(jī)制。運(yùn)用RT-PCR及免疫組化方法,我們的結(jié)果顯示orexin及OX1R和OX2R的mRNA和蛋白均存在于大鼠視網(wǎng)膜中。Orexin-A和B的免疫熒光染色在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的許多細(xì)胞上可見。免疫雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示,在外層視網(wǎng)膜,orexin-A和B表達(dá)在calbindin標(biāo)記的水平細(xì)胞和homeobox protein Chx10標(biāo)記的雙極細(xì)胞上。在內(nèi)層視網(wǎng)膜,orexin-A和B均表達(dá)在GABA能無長突細(xì)胞(amacrine cell, AC)上,包括酪氨酸羥化酶標(biāo)記的多巴胺能AC和膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶標(biāo)記的膽堿能AC上。甘氨酸能AC(包括AII型AC)也表達(dá)這兩種肽。此外,orexin-A和B在所有cholera toxin B (CTB)逆行標(biāo)記的GC上也有明顯表達(dá)。OX1R表達(dá)在大部分GC和多巴胺能AC上,并在兩個(gè)網(wǎng)狀層上也有彌散的分布。與之形成對(duì)照的是,在大鼠視網(wǎng)膜中未檢測到明顯的OX2R的免疫熒光染色。這些結(jié)果提示,orexm可能參與調(diào)節(jié)內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù),在大鼠視網(wǎng)膜薄片上,我們首先鑒定了L型鈣電流。在細(xì)胞外液中,用5 mM Ba2+取代Ca2+,并施加TTX、TEA分別阻斷電壓門控鈉通道和非選擇性鉀通道,將細(xì)胞鉗制于-40 mV,去極化到0 mV,引出內(nèi)向電流,此電流可被L型鈣通道特異性激動(dòng)劑BayK8644增大,并能被L型鈣通道特異性阻斷劑nifedipine阻斷。接著,我們進(jìn)一步研究了orexin-A對(duì)GC上L型鈣電流的調(diào)制作用。結(jié)果顯示,orexin-A能顯著增大L型鈣電流,并能被洗回。當(dāng)胞外給予OX1R特異性阻斷劑SB334867時(shí)可取消orexin-A對(duì)L型鈣電流的增大作用,而OX2R特異性阻斷劑TCS OX2 29則沒有作用,表明orexin-A對(duì)L型鈣電流的調(diào)制作用經(jīng)由OX1R介導(dǎo)。L型鈣通道的激活和穩(wěn)態(tài)失活均不受orexin-A的影響。進(jìn)而,我們詳細(xì)研究了orexin-A增大L型鈣電流的胞內(nèi)機(jī)制。胞內(nèi)施加G蛋白抑制劑GDP-β-S后,orexin-A不再增大L型鈣電流,提示G蛋白參與上述作用。磷脂酰肌醇磷脂酶C (phosphatidylinositol phospholipase C, PI-PLC)抑制劑U73122可明顯減弱orexin-A的作用,而磷脂酰膽堿磷脂酶C(phosphatidylcholine phospholipase C, PC-PLC)抑制劑D609卻不起作用。此外,胞內(nèi)施加10 mM BAPTA使細(xì)胞處于Ca2+-free條件下,再施加orexin-A,作用消失,說明orexin-A的作用有胞內(nèi)鈣的參與。當(dāng)給予xestospongin-C (XeC)或肝素(heparin)阻斷IP3受體介導(dǎo)的鈣庫釋放,orexin-A的作用消失,而胞內(nèi)給予ryanodine阻斷ryanodine受體介導(dǎo)的鈣庫釋放,orexin-A仍能增大L型鈣電流。因此, orexin-A增大L型鈣電流依賴于IP3受體介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+。L型鈣電流的增大也可被蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制劑bisindolymeleimide Ⅳ (Bis Ⅳ)和Go6976所阻斷。然而,蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制劑KT5720或激動(dòng)劑cAMP和蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)抑制劑KT5823或激動(dòng)劑cGMP均不影響orexin-A對(duì)GC上L型鈣電流的增大作用。綜上所述,本工作研究了orexin-A和B及其受體在大鼠視網(wǎng)膜上的分布,并進(jìn)一步顯示orexin-A與GC胞膜上的OX1R結(jié)合后,激活G蛋白/PI-PLC/IP3/Ca2+/PKC信號(hào)通路,進(jìn)而增大GC的L型鈣電流。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R774.1

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本文編號(hào)：2456478