研究背景： p-腎上腺素受體阻滯劑(p-受體阻滯劑)自1960年代以來廣泛應(yīng)用于以心血管疾病為主的臨床醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。在眼科方面,其家族中噻嗎心安等亦普遍應(yīng)用于青光眼疾病的治療。近年來,非選擇性p-受體阻滯劑普萘洛爾被證實對血管內(nèi)皮細胞具有明顯的抑制作用,并且可以進一步下調(diào)VEGF、bFGF等與血管瘤生成密切相關(guān)的血管生成因子,因此在血管瘤的臨床治療方面獲得了有效地推廣,有望取代傳統(tǒng)的治療方法成為一線藥物。隨后,有報道將普萘洛爾抑制新生血管以治療血管瘤的作用運用于小鼠高氧誘導(dǎo)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型中新生血管的治療,亦達到了一定的抑制作用。 正常角膜無血管、無淋巴管的特性,是維持其透明度及免疫赦免的必要條件。當感染、外傷、免疫反應(yīng)等病理因素破壞這一無血管的平衡狀態(tài)時,新生血管便會從角膜緣血管網(wǎng)侵入角膜,破壞角膜微環(huán)境,導(dǎo)致其正常結(jié)構(gòu)和功能的受損,嚴重情況下甚至造成視功能喪失。角膜新生血管作為最常見的致盲原因之一,及角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素,一直是眼科研究領(lǐng)域所面臨的最重要的問題之一。前述研究均與角膜新生血管的治療研究有共同的理論基礎(chǔ)。目前,國內(nèi)外尚無普萘洛爾針對角膜新生血管疾病模型治療作用的研究。 角膜新生血管的動物模型是研究新生血管調(diào)控機制,探索和評價其防治方法的重要手段。小鼠角膜堿燒傷模型作為經(jīng)典模型之一,能夠逼真地再現(xiàn)角膜堿燒傷的病理狀態(tài),是研究炎癥性新生血管發(fā)生機制和治療的重要手段。由于該模型成本不高,便與標準化操作及重復(fù)性好等優(yōu)點,得到廣泛應(yīng)用。 角膜新生血管的出現(xiàn)依賴于機體產(chǎn)生的各種促血管生長及抑制血管生長的因子--包括炎癥因子、生長因子、各種酶類等,互相調(diào)節(jié)形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。對這一網(wǎng)絡(luò)各環(huán)節(jié)的大量研究為尋找新生血管治療靶點提供了有效依據(jù)。 VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強的促血管生成因子,與生理性血管生成和病理性新生血管形成密切相關(guān)。VEGF能夠角膜新生血管形成過程中增強內(nèi)皮細胞的增殖與遷移、參與血管基底膜的降解和增加血管滲透性。bFGF屬于成纖維細胞生長因子家族,能刺激細胞有絲分裂,誘導(dǎo)新生血管生成,在機體的血管生成、神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育及創(chuàng)傷愈后過程中都起著十分重要的作用。IGF-1是一種既有胰島素樣合成代謝作用,又有促生長作用的多肽生長因子,幾乎存在于機體所有組織中,同樣可以促進新生血管的形成。在血管瘤的病理演變過程中,VEGF和bFGF是最密切相關(guān)的促血管生長因子,當對普萘洛爾抑制血管瘤的機制進行研究時,VEGF和bFGF的表達出現(xiàn)明顯下調(diào),加速血管瘤的退化；而在普萘洛爾抑制小鼠缺氧誘導(dǎo)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型中新生血管的研究中,VEGF和IGF-1通過各自的通路下調(diào)表達水平,進而達到減輕新生血管的治療目的。 第一部分普萘洛爾對體外培養(yǎng)小鼠角膜上皮細胞,小鼠角膜基質(zhì)成纖維細胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的作用 目的： 通過體外實驗,初步確定普萘洛爾對參與CNV生發(fā)的三種主要細胞—小鼠角膜上皮細胞(MCEC)、小鼠角膜基質(zhì)成纖維細胞(MCSFC)和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)--的毒性作用,為下一步的實驗和臨床研究奠定理論依據(jù)。 方法： 1.健康成年(9-11周齡)清潔級Balb/c小鼠6只,取新鮮角膜進行小鼠角膜上皮細胞、小鼠角膜基質(zhì)成纖維細胞；取新鮮離體人臍帶,進行人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)。CD31免疫熒光染色鑒定P3代HUVEC。 2.取P1代MCEC和MCSFC, P3代HUVEC,通過MTT比色法檢測普萘洛爾對前述三種細胞半量抑制濃度(IC50)值。各組細胞分別加入100μ1／孔新鮮配制鹽酸普萘洛爾梯度濃度培養(yǎng)基,按序10-1-10-8M,重復(fù)三次。培養(yǎng)24Hr后,加入MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔酶標儀在570nmm波長處檢測OD值,并換算相應(yīng)Mean(細胞死亡率%),通過4PL Curve Analysis確定IC50值(M) 3.取P1代MCEC和MCSFC, P3代HUVEC,通過7AAD染色經(jīng)流式細胞儀檢測普萘洛爾對前述三種細胞存活率的影響。各組細胞分別加入含130μg鹽酸普萘洛爾的新鮮培養(yǎng)基5ml(普萘洛爾終濃度10-4M),培養(yǎng)24Hr,取106細胞+100μl7AAD (200μg/ml)+1ml PBS均勻混合于流式細胞儀下進行活細胞分選,GraphPad Prism軟件分析。 結(jié)果： 1.P1代小鼠角膜上皮細胞貼壁生長,單層融合,細胞較大,呈典型的多角形鋪路石狀形態(tài)；P1代小鼠角膜基質(zhì)成纖維細胞貼壁生長,單層融合,細胞邊界清楚,胞漿豐富,呈梭形規(guī)整排列；P3代人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞貼壁生長,單層融合,細胞邊界清楚呈多角形、圓形或橢圓形,胞漿豐富,排列規(guī)整。 2.熒光倒置顯微鏡下見,所測P3代HUVEC的CD31-GFP熒光陽性反應(yīng)率95%,證明所培養(yǎng)的細胞是人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞。 3.IC50值：MCEC為10-3,165M,MCSFC為10-3,955M,HUVEC為10-4.866M。說明體外培養(yǎng)時,普萘洛爾誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的能力高于對小鼠角膜上皮和基質(zhì)細胞的誘導(dǎo)能力。 4.在含10-4M普萘洛爾的培養(yǎng)基中,MCEC和MCSFC的存活率不受普萘洛爾影響,而HUVEC的存活率有明顯降低。 結(jié)論： 普萘洛爾的半數(shù)抑制濃度在三種細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)為：HUVEC MCSFCMCEC。在使用同一濃度(104M)的情況下,角膜新生血管形成過程中主要細胞成分對普萘洛爾具有不同反應(yīng),HUVEC對普萘洛爾藥物毒性的耐受度低于MCEC和MCSFC.說明在不影響上皮細胞與基質(zhì)細胞修復(fù)的情況下,血管內(nèi)皮細胞的死亡可以降低角膜新生血管的發(fā)生率或促進角膜新生血管的消退,為減少CNV在損傷修復(fù)過程中的有害作用提供了體外實驗依據(jù)。 第二部分普萘洛爾對小鼠角膜堿燒傷模型中新生血管的抑制作用 目的： 建立可靠有效的小鼠角膜堿燒傷模型,通過體內(nèi)實驗,觀察炎癥相關(guān)性CNV的增殖過程,及不同時期角膜樣本的組織病理學(xué)變化；比較口服及腹腔內(nèi)注射兩種不同給藥途徑下普萘洛爾對CNV的抑制作用；并與無外界其他干擾因素下的堿燒傷正常病理過程進行對照,為進一步證實普萘洛爾對CNV的抑制作用尋找治療依據(jù)。 方法： 1.200只Balb/c小鼠建立左眼角膜堿燒傷模型(濾紙片直徑2mm,0.5mol/L NaOH溶液,燒灼20s)。隨機將角膜堿燒傷3日后Balb/c小鼠平均分為3組,分別為生理鹽水對照組(對照/Control組),予腹腔注射生理鹽水0.5ml；腹腔內(nèi)普萘洛爾給藥組(腹腔注射/IP組),予0.04%鹽酸普萘洛爾溶液0.5m1；及灌胃普萘洛爾給藥組(口服/PO組),予0.04%鹽酸普萘洛爾溶液0.5m1。三組分別在建模成功后第4、5、6日給予處理,2次/日。 2.記錄裂隙燈下建模成功后3D、7D、10D、14D小鼠眼前節(jié)情況,進行分析,并對角膜炎癥積分計算(包括新生血管評分、角膜水腫評分和眼內(nèi)滲出或出血評分)。 3.于建模后3D和各組7D、10D、14D,隨機取5只小鼠/組,行角膜HE染色組織病理學(xué)檢查。 4.于建模后3D和各組7D、10D、14D,隨機取5只小鼠/組,行角膜免疫組織化學(xué)CD31表達檢查,并于共聚焦顯微鏡下拍照,Image J圖像處理系統(tǒng)分析CNV生長指數(shù)。 結(jié)果： 1.裂隙燈大體觀察記錄顯示,在建模后3D-14D的病理過程中,角膜新生血管長度、水腫程度、眼內(nèi)出血及滲出情況均表現(xiàn)為：IP組程度最輕,消退速度最快;PO組其次；對照組最重且最慢。 2.角膜炎癥積分的變化趨勢顯示,對照組的樣本炎癥情況在3D到10D(2.92±0.51至4.33±0.49)過程中隨時間增加處于上升趨勢并達到頂峰,至14D(2.17±0.72)炎癥好轉(zhuǎn)；腹腔注射組的樣本炎癥情況表現(xiàn)為3D高于7D(2.92±0.51至2.25±0.45),至10D(2.42±0.51)保持穩(wěn)定,無明顯變化,14D(1.08±0.29)時明顯下降；PO組的樣本炎癥情況在3D到7D(2.92±0.51至3.25±0.75)過程中隨時間增加處于上升趨勢并達到頂峰,至10D(3.17±0.58)呈現(xiàn)穩(wěn)定,14D(1.33±0.49)明顯好轉(zhuǎn)。說明炎癥量化結(jié)果為：IP組最輕及持續(xù)時間最短,PO組其次,對照組最重及持續(xù)時間最長。 3.HE組織病理學(xué)檢查結(jié)果與炎癥大體觀察變化趨勢基本一致,在新生血管生長方面,基質(zhì)水腫程度、炎癥細胞浸潤及上皮愈合情況各方面,均為IP組最輕及持續(xù)時間最短,PO組其次,對照組最重及持續(xù)時間最長。 4.CNV生長面積(%)比較可知,對照組CNV面積增長在3D-10D(11.81±1.210至35.47±1.780)這一過程中與炎癥變化一致,14D(34.22±2.430)時相比10D保持穩(wěn)定；IP組CNV生長面積在3D-7D(11.81±1.210至12.76±2.110)保持穩(wěn)定,自10D(10.19±2.395)起隨時間增加處于大幅下降趨勢,至14D(5.840±1.320)并且明顯低于3D時水平；；PO組CNV生長面積在3D-10D(11.81±1.210至27.69±1.930)過程中隨時間增加處于上升趨勢并達到頂峰,14D(20.33±1.050)明顯下降。三組變化趨勢與前述結(jié)果基本一致,為IP組CNV程度最輕,消退速度最快；PO組其次；對照組最重且最慢。 結(jié)論： 使用0.5mol/L NaOH浸泡濾紙片在角膜中央直徑2mm區(qū)域內(nèi)燒灼20s的優(yōu)化方式建立Balb/c小鼠角膜堿燒傷模型,可以成功誘導(dǎo)出炎癥性角膜新生血管,在評價普萘洛爾對CNV抑制作用的同時,局限了炎癥的發(fā)展,避免多重因素的干擾作用,最大限度的提高了模型的利用率,清晰地呈現(xiàn)普萘洛爾在各組中不同的治療作用。當CNV出現(xiàn)后,將0.04%的普萘洛爾按0.5m1/只,一日兩次,連續(xù)三日的劑量應(yīng)用在這一模型上時,可以顯著抑制CNV的生長,減少新生血管面積,并且控制炎癥的發(fā)展,既發(fā)揮了新生血管在角膜修復(fù)過程中增加微循環(huán)以促進代謝的積極作用,又降低了炎癥和新生血管互相刺激對修復(fù)產(chǎn)生的不利影響,最終加速了角膜的修復(fù),使CNV提前進入了消退期。由于普萘洛爾脂溶性影響了口服利用率,所以最終對CNV的抑制作用表現(xiàn)為IP組PO組對照組。 第三部分普萘洛爾對小鼠角膜堿燒傷新生血管模型中VEGF、IGF-1和bFGF的表達影響 目的： 通過對VEGF、IGF-1和bFGF三種與普萘洛爾調(diào)節(jié)新生血管機制密切相關(guān)的促血管生長因子表達變化的檢測,確定普萘洛爾抑制小鼠角膜堿燒傷模型中CNV時在基因和蛋白水平的產(chǎn)生的影響,為普萘洛爾抑制CNV的作用尋找更深入可靠的實驗依據(jù),也為CNV的藥物治療提供新的應(yīng)用思路。 方法： 1.200只Balb/c小鼠建立左眼角膜堿燒傷模型(濾紙片直徑2mm,0.5mol/L NaOH溶液,燒灼20s)。隨機將角膜堿燒傷3日后Balb/c小鼠平均分為3組,分別為生理鹽水對照組(對照/Control組),予腹腔注射生理鹽水0.5m1；腹腔內(nèi)普萘洛爾給藥組(腹腔注射/IP組),予0.04%鹽酸普萘洛爾溶液0.5ml；及灌胃普萘洛爾給藥組(口服/PO組),予0.04%鹽酸普萘洛爾溶液0.5ml。三組分別在建模成功后第4、5、6日給予處理,2次/日。 2.隨機取建模后3D和各組7D、10D、14D小鼠各5只,逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測小鼠角膜VEGF、IGF-1、bFGF的基因表達率。電泳結(jié)果采用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析,結(jié)果以VEGF、IGF-1、bFGF與內(nèi)參GAPDH mRNA擴增產(chǎn)物的灰度相對比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。 3.隨機取建模后3D和各組7D、10D、14D小鼠各5只,ELISA檢測小鼠角膜VEGF、IGF-1、bFGF的蛋白表達量并進行統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果： 1.由RT-PCR結(jié)果可知,VEGF基因表達率(%)為：對照組3D-10D(41.00±2.95至83.42±5.62)期間,VEGF隨時間增加而增多,達到頂峰,14D(32.92±3.58)時明顯回落,低于3D時水平；IP組3D和7D期間(41.00±2.95至41.42±3.94)保持穩(wěn)定,隨后隨時間增加而明顯下降,14D(4.50±2.28)時降幅極其顯著；PO7D(55.50±4.78)時明顯高于3D(41.00±2.95),7D-10D(57.58±5.60)期間保持穩(wěn)定,14D(21.33±2.84)時出現(xiàn)顯著降低。因此IP組VEGF基因表達率程度最輕,降低最快；PO組其次；對照組最重且最慢。 2.由RT-PCR結(jié)果可知,IGF-1基因表達率(%)為：對照組,3D-7D(61.00±3.86至61.33±3.85)期間保持穩(wěn)定,10D(72.33±3.55)出現(xiàn)增加,14D(59.75±2.93)時明顯回落；腹腔注射組,3D-14D(61.00±3.86至37.17±3.04)期間隨時間增加而明顯下降；口服組,3D-10D(61.00±3.86至59.75±3.96)期間保持穩(wěn)定,14D(47.42±2.99)時出現(xiàn)顯著降低。由此可知,7D時IGF-1基因表達率在對照組和PO組間無明顯變化,IP組明顯低于前兩組,而10D和14D時,基因表達率均為對照組PO組IP組。 3.由RT-PCR結(jié)果可知,bFGF基因表達率(%)為：對照組中,7D(60.08±3.03)高于3D(55.83±2.72)時,10D(50.00±3.36)出現(xiàn)回落,10D-14D(49.17±2.37)期間保持穩(wěn)定；IP組,3D-10D(55.83±2.72至45.17±3.38)期間隨時間增加而明顯下降,10D-14D(42.75±2.93)期間保持穩(wěn)定；PO組,3D-7D(55.83±2.72至56.83±3.30)期間保持穩(wěn)定,10D(48.00±3.30)時出現(xiàn)顯著降低,10D-14D(46.58±4.68)期間保持穩(wěn)定。由此可知,7D-14D各時間時bFGF基因表達率在對照組和PO組間均無明顯變化,IP組明顯低于前兩組。 4.由Elisa結(jié)果可知,VEGF蛋白表達量(pg/ml)為：對照組3D-10D(105.56±8.21至150.24±4.70)期間,VEGF隨時間增加而增多,達到頂峰,14D(74.06±4.39)時明顯回落,低于3D時水平；IP組7D(91.07±7.89)時較3D(105.56±8.21)時明顯降低,其后隨時間增加持續(xù)下降,降幅極其顯著(至19.88±1.43)；PO組3D-7D(105.56±8.21至112.82±7.92)期間保持穩(wěn)定,隨后隨時間增加而明顯下降(至42.01±4.94)。各組蛋白水平變化趨勢與基因水平基本一致,表現(xiàn)為IP組表達量最低,降低最快；PO組其次；對照組最高且最慢。 5.由Elisa結(jié)果可知,IGF-1蛋白表達量(pg/ml)為：對照組,3D-7D(173.33±10.44至254.69±13.53)期間增長,10D(227.59±14.11)起出現(xiàn)下降,至14D(167.92±3.94)持續(xù)下降；腹腔注射組,3D-14D(173.33±10.44至82.90±4.45)期間隨時間增加而明顯下降；PO組,3D-7D(173.33±10.44至187.34±10.70)期間保持穩(wěn)定,隨后隨時間增加而明顯下降(至132.31±2.98)。各組蛋白水平變化趨勢與基因水平基本一致。 6.由Elisa結(jié)果可知,bFGF蛋白表達量(pg/ml)為：對照組3D-7D(140.67±3.69至177.78±3.29)期間增長,10D(162.61±6.48)起出現(xiàn)下降,至14D(131.27±4.33)持續(xù)下降；IP組3D-7D(140.67±3.69至140.48±7.04)期間保持穩(wěn)定,隨后隨時間增加持續(xù)下降(至71.06±3.02)；PO組7D(153.36±3.90)時高于3D(140.67±3.69),10D(131.99±±5.38)出現(xiàn)顯著降低10D-14D(至127.68±4.0)期間保持穩(wěn)定。7D-10D各時間點均為對照組口服組腹腔注射組,14D時對照組和口服組間無明顯變化,腹腔注射組明顯低于前兩組。各組蛋白水平變化趨勢與基因水平基本一致, 結(jié)論： 普萘洛爾對CNV的抑制作用建立在對多種促血管生成因子共同調(diào)控的基礎(chǔ)上,通過對炎癥性CNV病理過程中這些因子不同程度的下調(diào),達到抑制新生血管形成,促進其消退的目的,從微觀層面印證了在前述小鼠模型中所得出的結(jié)論。我們在小鼠角膜堿燒傷模型中率先驗證了普萘洛爾對新生血管的抑制作用,為后續(xù)相關(guān)研究提供了可靠有效的實驗依據(jù),同時結(jié)合普萘洛爾這種經(jīng)典藥物安全、便宜、療效顯著等優(yōu)點,向CNV治療的多元化發(fā)展提供了潛在的藥物選擇。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R779.1

【參考文獻】

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本文編號：2456022