【摘要】：縫隙連接(gap junction, GJ)為溝通相鄰細(xì)胞胞質(zhì)的胞間通道,其在細(xì)胞膜上緊密聚集成簇,通過介導(dǎo)細(xì)胞間縫隙連接通訊(gap junctional intercellular communication, GJIC)參與胞間物質(zhì)、能量的交換和信息的傳遞,因而對細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化,神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持具有重要作用。 縫隙連接蛋白(Connexins, Cxs)為一類具有較高同源性的蛋白超家族,是構(gòu)成GJ的基本單位。在眼部,Cxs已被證實存在于角膜、晶狀體、虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜等多處。Connexin 43作為主要的縫隙連接蛋白,在睫狀體中主要表達于雙層上皮細(xì)胞,而在睫狀肌和基質(zhì)中則未見表達。鑒于Cx43特定的表達位置及其功能上的重要性,越來越多的研究者開始關(guān)注其與房水生成之間的聯(lián)系,并圍繞Cx43的磷酸化調(diào)控,以及Cx43與房水生成相關(guān)機制進行了一些列相關(guān)研究。 在眼部,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)含量豐富,其催化生成的一氧化氮(nitric oxide, NO)作為一種活躍的信號分子,可以通過激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)與鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase, GC)來增強細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(adenosine 3',5'-cyclic monophosphate)和環(huán)磷酸鳥苷(guanosine 3',5'-cyclic monophosphate, cGMP)的表達。后者作為細(xì)胞間重要的第二信使在調(diào)控Cx43表達和通道功能上起重要作用,且一些藥物能夠加強或者減弱該作用。眼內(nèi)可能存在多種信號通路,通過調(diào)節(jié)Cx43的表達和通道功能而影響房水生成過程。 本研究旨在研究縫隙連接蛋白Cx43在離體人眼和牛眼睫狀體的表達與分布,以及NO對其表達的調(diào)控作用,我們目前的研究結(jié)果提示NO作為一種有效的刺激物能夠促進睫狀體雙層上皮細(xì)胞間Cx43的表達,并且進一步證實了NO的該種作用主要依賴于其下游的cGMP/PKG及cAMP/PKA信號通路的激活。本研究對進一步研究房水生成分子機制,了解某些抗青光眼藥物的降眼壓機制具有重要意義。具體包括： 第一部分 一氧化氮合酶和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體和小梁網(wǎng)中的表達及分布的研究 [研究目的] 研究神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)及鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase, GC)在人眼睫狀體和小梁網(wǎng)的表達與分布。 [材料和方法] 收集10例眼外傷后48小時內(nèi)摘除的病人眼球(排除其他眼部病史),常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色光鏡下觀察。切片脫色素后以免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測nNOS、iNOS、eNOS及GC在睫狀體中和小梁網(wǎng)中的表達,以磷酸緩沖液(PBS)代替上述各種一抗作為陰性對照。光鏡下讀片以顯色強度和陽性細(xì)胞密度相結(jié)合作為定性指標(biāo)。 [研究結(jié)果] 三種一氧化氮合酶(NOS)及鳥苷酸環(huán)化酶(GC)在離體人眼睫狀體上皮、睫狀肌、小梁網(wǎng)和Schlemm's管內(nèi)皮中均有廣泛表達。在睫狀體中,nNOS表達較強,主要表達在色素上皮(PE)和非色素(NPE)上皮細(xì)胞胞漿的頂端交界處。iNOS及eNOS在PE與NPE兩種上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻表達。在部分睫狀突中,GC在PE和NPE細(xì)胞胞漿中均勻分布,而在其他睫狀突中,GC在PE和NPE細(xì)胞胞漿頂端交界處表達較強。 [研究結(jié)論] 三種NOS亞型及GC在離體人眼睫狀體上皮、睫狀肌、小梁網(wǎng)和Schlemm's管內(nèi)皮中均有廣泛表達。nNOS和GC的特定表達模式提示NO/cGMP信號通路其可能參與了人眼睫狀體跨上皮細(xì)胞間離子轉(zhuǎn)運,因而可能參與了房水生成的調(diào)節(jié)過程。 第二部分 縫隙連接蛋白Connexin43及Connexin40在離體人眼和牛眼睫狀體中的表達 [研究目的] 研究兩種常見的縫隙連接蛋白即縫隙連接蛋白43(Connexin43, Cx43和縫隙連接蛋白40(Connexin40, Cx40在正常人眼和牛眼睫狀體的表達及分布。 [材料和方法] 收集10例眼外傷后48小時內(nèi)摘除的病人眼球(排除其他眼部病史)和10例當(dāng)?shù)赝涝讏鲂迈r摘取的牛眼球(排除眼球破裂和眼內(nèi)炎眼球),常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色光鏡下觀察。切片脫色素后以免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測Cx43和Cx40在離體人眼睫狀體中的表達,以及Cx40在離體牛眼睫狀體的表達。以磷酸緩沖液(PBS)代替上述各種一抗作為陰性對照。光鏡下讀片以顯色強度和陽性細(xì)胞密度相結(jié)合作為定性的指標(biāo)。 [研究結(jié)果] Cx43在離體人眼及牛眼睫狀體中均存在基礎(chǔ)表達。其陽性染色密集分布于色素上皮(PE)和非色素(NPE)上皮細(xì)胞胞漿.頂端交界處。部分見于PE細(xì)胞交界處與其胞漿內(nèi)。Cx40在離體人眼睫狀體組織呈陰性表達。 [研究結(jié)論] Cx43在離體人眼和牛眼睫狀體上皮的分布模式, Cx43通道可能作為人眼和牛眼睫狀體上皮細(xì)胞間主要的縫隙連接通道來參與房水生成。 第三部分 NO-cGMP/cAMP信號通路對人眼與牛眼睫狀體Connexin43表達影響的研究 [研究目的] 研究一氧化氮(Nitric Oxide, NO)及其下游信號分子環(huán)磷酸腺苷(Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate, cGMP)對離體人眼和牛眼睫狀體縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)表達的調(diào)控作用及可能機制。 [材料和方法] 蛋白印跡(Western blot)法分別檢測離體人眼和牛眼睫狀體中Cx43蛋白的表達。將睫狀體組織分別與與NO供體硝普鈉(SNP,100gM)、cAMP替代物8-Bromo-cAMP (250μM)和cGMP替代物8-Bromo-cGMP (500μM)共同孵育18小時,并用上述藥物下游通道的抑制劑阻斷其效應(yīng),半定量分析對照組、SNP組、8-Bromo-cAMP組、8-Bromo-cGMP組和各抑制劑組Cx43蛋白表達的差異。 [研究結(jié)果] 蛋白印跡法檢測到Cx43在離體人眼及牛眼睫狀體存在基礎(chǔ)表達。SNP,8-Bromo-cAMP,8-Bromo-cGMP能在18小時內(nèi)顯著增加Cx43蛋白的基礎(chǔ)表達,PKA抑制劑H89在一定程度上抑制了SNP和8-Bromo-cAMP對Cx43蛋白表達量的上調(diào)。PKG抑制劑KT5823在一定程度上能夠抑制SNP和8-Bromo-cGMP對Cx43蛋白表達量的上調(diào),sGC抑制劑ODQ在一定程度上可抑制SNP對Cx43蛋白表達量的上調(diào)。 [研究結(jié)論] 本研究提示NO能上調(diào)人眼和牛眼睫狀體Cx43的表達,該調(diào)節(jié)作用可能由cAMP/PKA和cGMP/PKG兩條信號通路所介導(dǎo)。推測NO可能參與了人眼和牛眼房水生成的調(diào)節(jié)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R776

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Growth hormone regulates intestinal ion transport through a modulation of the constitutive nitric oxide synthase-nitric oxide-cAMP pathway[J];World Journal of Gastroenterology;2006年29期

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本文編號：2453464