【摘要】：前言白內障是世界首位致盲性眼病。目前,其治療仍以手術為主,但手術給個人、家庭及社會帶來了沉重的負擔。因此,深入研究其發(fā)病機制,進行早期干預,具有重要的現實和臨床意義。αA晶狀體蛋白(alpha A crystallin, CRYAA)是晶狀體內主要蛋白質之一,對維持晶狀體的透明性具有重要作用。它的分子伴侶功能可以防止晶狀體內蛋白質變性,保護細胞免受外界環(huán)境損傷的刺激、抵抗各種因素導致的細胞凋亡。因此,本研究圍繞αA晶狀體蛋白,一方面從DNA水平探討CRYAA基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)與年齡相關性白內障(age-related cataract, ARC)的關系,分析晶狀體內CRYAA表達量差異的原因；另一方面從蛋白質水平鑒定CRYAA相互作用的蛋白質,以及其形成的蛋白質相互作用網絡在ARC發(fā)生發(fā)展中所起的作用。第一部分CRYAA啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與年齡相關性白內障易感性的關系研究目的晶狀體中CRYAA的表達量在ARC患者和對照者中存在差異,而啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性是影響基因表達的因素之一。因此,本研究探討CRYAA啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與年齡相關性白內障易感性的關系。方法(1)觀察CRYAA啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與ARC的相關性：研究共納入243例ARC患者(核性白內障C2NO3P2)和1348例正常對照者(核性白內障C2NO2P2)。采集所有研究對象外周靜脈血5ml,提取基因組DNA, PCR擴增CRYAA基因啟動子-1--1000區(qū)域,對PCR產物進行DNA測序,鑒定CRYAA啟動子區(qū)SNP位點。通過SHEsis在線分析平臺分析ARC組和對照組在等位基因頻率和基因型頻率上的分布差異,并通過Haplotype分析觀察SNP位點之間的協同作用關系。(2)檢測SNP對基因表達的影響：合成CRYAA啟動子-1--1000區(qū)域的DNA序列,將其克隆至pGL3-Basic質粒載體,形成pGL3-Basic-CRYAA載體；根據CRYAA基因啟動子區(qū)域鑒定結果,使用定點突變技術構建rs7278468的SNP位點突變質粒pGL3-Basic-rs7278468載體,轉染至293T細胞,進行雙熒光素酶報告基因實驗,檢測啟動子效率。結果CRYAA啟動子-1--1000區(qū)域共鑒定到6個SNP位點：rs3761381, rs3761382, rs79545821, rs13053109, rs7278468和rs117396767。在等位基因頻率分布上,只有rs7278468位點在ARC組和對照組之間均存在顯著差異(P0.05),對照組次要等位基因出現頻率大于ARC組；在基因型頻率分布上,6個SNP位點在ARC組和對照組之間均不存在顯著差異(P0.05)。Haplotype分析結果顯示：個體出現C-C-G-G-T-C分型是ARC發(fā)病的危險因素(P=0.027,OR=1.258),而出現T-C-A-G-G-C是ARC的保護性因素(P=0.038,OR=0.736)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示SNP位點rs7278468次要等位基因的出現增強了啟動子效率,進而細胞內CRYAA表達量上升。結論CRYAA基因啟動子區(qū)SNP是個體ARC發(fā)病風險差異的遺傳學基礎。單個位點的SNP影響CRYAA的蛋白質表達量。多個SNP位點間的協同作用則對ARC發(fā)生發(fā)展有著不同的影響：Haplotype分型C-C-G-G-T-C是其危險因素,而Haplotype分型T-C-A-G-G-C是其保護性因素。第二部分CRYAA蛋白質相互作用網絡在年齡相關性白內障中的作用研究目的CRYAA分子伴侶功能的本質是蛋白質之間的相互作用,因此本研究通過蛋白芯片的方法鑒定與CRYAA相互作用的蛋白質,分析其蛋白質網絡在ARC發(fā)展中可能存在的作用。方法 (1)相互作用蛋白質的鑒定：使用含有人類蛋白質組17225個蛋白質的HuProt蛋白芯片鑒定蛋白質相互作用。根據CRYAA的1-173個氨基酸合成CRYAA蛋白質,將4ng/μl的CRYAA與蛋白芯片共同孵育1.5小時(對照組給予PBST溶液),其后分別給予CRYAA一抗(1：1000)和IgG-Cy3標記的二抗(1：200)各孵育1小時。使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀檢測陽性信號,讀取芯片上每點F532和B532數值,并根據公式計算信噪比(Signal Noise Ratio, SNR): SNR=MeanF532-MeanB532/SDB532。選擇SNR≥1.2作為篩選CRYAA相互作用蛋白質的標準。對鑒定到SNR≥1.2的蛋白質,通過Gene Ontology和DAVID網站進行蛋白質生物學功能分析,通過string和KEGG蛋白質組學網絡分析蛋白質之間的相互聯系,進而建立CRYAA蛋白質相互作用網絡,分析CRYAA參與的影響ARC發(fā)生發(fā)展的生物學進程。(2)選取數個蛋白芯片鑒定到的CRYAA相互作用蛋白質進行細胞內驗證：合成CRYAA基因編碼區(qū)DNA序列,克隆至p3xFlag-CMV-7.1 質粒載體,形成 p3xFlag-CMV-CRYAA質粒載體。將p3xFlag-CMV-CRYAA載體轉染至293T細胞,使細胞內表達帶有Flag標簽的CRYAA。轉染24小時后,將全蛋白裂解液與抗Flag的M2 beads共同孵育,從而免疫共沉淀CRYAA與其相互作用蛋白質形成的復合物,經Western blot鑒定此復合物中與CRYAA相互作用的蛋白質。結果對照組共有343個蛋白質信號強度高于CRYAA組,其中127個蛋白質SNR≥1.2。8個CRYAA相互作用蛋白質SNR≥3.0：造血細胞特異性Lyn底物蛋白1 (hematopoietic cell-specific Lyn substrate 1, HCLS1)、Kelch樣蛋白6(Kelch domain containin 6, KLHDC6)、肌營養(yǎng)蛋白δ(sarcoglycan delta, SGCD)、KIAA1706蛋白(KIAA1706 protein, KIAA1706)、5’-三磷酸尿苷轉移酶(RNA guanylyltransferase and 5'-phosphatase, RNGTT)、10號染色體開放閱讀框57 (chromosome 10 open reading frame 57, C10orf57),9號染色體開放閱讀框52 (chromosome 9 open reading frame 52, C9orf52)和尿激酶型纖溶酶原激活物受體(plasminogen activator, urokinase receptor, PLAUR)。通過Gene Ontology 和 DAVID網站進行生物信息學分析,發(fā)現CRYAA相互作用的蛋白質涉及多種功能類別：磷酸化蛋白(Phosphoprotein)、選擇性剪切(Alternative splicing)、DNA結合蛋白(DNA binding)、細胞周期(Cell cycle)、細胞骨架(Cytoskeleton)、線粒體(Mitochondrion)、凋亡(Apoptosis)、蛋白水解(Proteolysis)、細胞對壓力的反應(Cellular response to stress)、DNA損傷修復(DNA repair)、自體吞噬(Autophagy)等。選取細胞骨架蛋白質HCLS1、MAPK信號通路蛋白MAPKBP1、MORG1和熱休克蛋白HSPB1進行驗證,結果顯示CRYAA在細胞內與這些蛋白質形成復合物,即通過與這些蛋白質相互作用從而行使其在不同生物學進程中的功能。結論CRYAA與多種蛋白質相互作用從而參與眾多生物學功能和進程,維持晶狀體的透明性：通過骨架蛋白維持細胞膜穩(wěn)定,如HCLS1；通過細胞周期蛋白質維持晶狀體上皮細胞活力；通過應激反應蛋白質降低氧化損傷的傷害：如HSPB1；通過凋亡通路(MAPK.P13K/AKt信號通路)及DNA損傷修復相關蛋白質抑制細胞凋亡,如MAPKBP1和MORGl；通過泛素化-蛋白酶體及自體吞噬系統促進蛋白質的降解。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R776.1

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1 樊琪;CRYAA啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其蛋白質相互作用網絡在年齡相關性白內障中的作用研究[D];復旦大學;2014年

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本文編號：2446998