發(fā)布時(shí)間：2019-03-17 21:18

【摘要】： 視網(wǎng)膜包括視桿與視錐兩種神經(jīng)回路,分別負(fù)責(zé)暗(弱光)視覺(jué)、無(wú)色視覺(jué)和明(強(qiáng)光)視覺(jué)、色覺(jué)信息的接受、加工和傳導(dǎo),這兩種感光系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。色覺(jué)是視覺(jué)的高級(jí)功能,色覺(jué)異常疾病在男性中的發(fā)病率可高達(dá)8%,是一種常見(jiàn)的遺傳疾病,被認(rèn)為是視覺(jué)傳導(dǎo)通路中一些基因的重組或點(diǎn)突變導(dǎo)致的。但由于缺乏先天性色覺(jué)異常疾病的模式動(dòng)物,對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究難以深入,因此,目前色覺(jué)異常疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)并培育了一種先天性視網(wǎng)膜錐細(xì)胞失功能(retinal cone dysfunction, RCD)大鼠,其遺傳表型為暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖基本正常,明適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖消失;組織結(jié)構(gòu)學(xué)結(jié)果顯示視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次完整,光感受器數(shù)量無(wú)明顯變化。本研究將對(duì)此模式動(dòng)物的致病基因、突變方式及功能等進(jìn)行研究,旨在了解該模式動(dòng)物的發(fā)病機(jī)制。 方法 1.建立突變型大鼠與野生型BN大鼠的雜交品系,得到的F1代大鼠雌雄配對(duì),獲得F2代大鼠。通過(guò)建立遺傳家系,明確遺傳方式。后續(xù)研究主要以F2代大鼠為研究對(duì)象。 2.采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)臨床視網(wǎng)膜電圖記錄方法,進(jìn)行表型鑒定。 3.應(yīng)用序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence tagged site,STS)和單倍體型(haplotype)分析方法,定位突變基因。 4.針對(duì)候選基因,采用基因克隆、測(cè)序等方法確定基因的突變方式,并觀察突變基因是否與表型一致。 5.應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法和免疫熒光方法,觀察突變基因在模式大鼠中的mRNA表達(dá)水平以及蛋白表達(dá)水平。 6.采用蘇木精-伊紅染色及全視網(wǎng)膜鋪片方法比較突變是否會(huì)影響不同年齡段的大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和錐體細(xì)胞的數(shù)量。 7.記錄不同光強(qiáng)、頻率及顏色光刺激下的視覺(jué)電生理反應(yīng),分析光感受器細(xì)胞的功能。 結(jié)果 1.將雌性突變型大鼠與雄性野生型BN大鼠雜交,子一代互交,收集到雜交二代大鼠共441只,所有大鼠均經(jīng)過(guò)臨床視覺(jué)電生理學(xué)檢測(cè)確定其表型。根據(jù)NCBI網(wǎng)站中提供的序列標(biāo)簽位點(diǎn)作為分子標(biāo)記物設(shè)計(jì)引物,對(duì)441只F2代大鼠分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。通過(guò)比較分子標(biāo)記物在不同個(gè)體中的擴(kuò)增產(chǎn)物,分析突變基因與分子標(biāo)記物間的交換重組率,結(jié)果顯示突變基因與DXRat21和DXRat96有連鎖關(guān)系,并位于X染色體的末端端粒區(qū)27.8 Mb的區(qū)域內(nèi)。此區(qū)域內(nèi)共有169個(gè)候選基因,只有中波長(zhǎng)視蛋白基因與視覺(jué)有關(guān)。 2.針對(duì)中波長(zhǎng)視蛋白基因的的6個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)引物、擴(kuò)增并測(cè)序,結(jié)果顯示第四內(nèi)含子3’端剪接位點(diǎn)處保守的AG雙堿基突變?yōu)锳T雙堿基。此突變?cè)?41只F2代大鼠中,除雄性正常表型大鼠外,其余個(gè)體中均存在;且在50只野生型SD大鼠和156種近交系大鼠中均未被發(fā)現(xiàn)。 3.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示,野生型SD大鼠中可以檢測(cè)到中波長(zhǎng)視蛋白基因mRNA的表達(dá),但是突變型大鼠中無(wú)法檢測(cè)到該基因mRNA的表達(dá),表明其轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到抑制;免疫熒光結(jié)果顯示,花生凝集素特異性標(biāo)記的錐體細(xì)胞在野生型和突變型大鼠中均可以檢測(cè)到,且正常表型的野生型SD大鼠中還可以檢測(cè)到中波長(zhǎng)視蛋白的表達(dá),但突變型大鼠中無(wú)法檢測(cè)到,中波長(zhǎng)視蛋白在突變型大鼠中未被表達(dá)。 4.蘇木精-伊紅染色方法觀察1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月和12個(gè)月野生型SD大鼠和突變型大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示突變型大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)、光感受器細(xì)胞層的厚度與同齡的野生型SD大鼠相比均未發(fā)生明顯變化;全視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果表明,同齡的突變型大鼠和野生型大鼠的錐體細(xì)胞的數(shù)量無(wú)明顯差異。中波長(zhǎng)視蛋白在野生型大鼠中表達(dá),而突變型大鼠中無(wú)法檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)。 5.視覺(jué)電生理學(xué)記錄結(jié)果顯示,在暗適應(yīng)條件下,隨著刺激光強(qiáng)的增強(qiáng),記錄到的視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)反應(yīng)的波幅值在突變型和正常表型大鼠中均逐漸增大;明適應(yīng)條件下,不同頻率、光強(qiáng)的光刺激均顯示出隨著光強(qiáng)的增強(qiáng),正常表型大鼠的波幅值逐漸增大,直至達(dá)到飽和狀態(tài),而突變型大鼠即使在最大光強(qiáng)刺激下也無(wú)法記錄到任何波形。顏色光刺激后,在明適應(yīng)環(huán)境中,突變型大鼠仍然無(wú)法記錄到任何波形。 結(jié)論 中波長(zhǎng)視蛋白基因中內(nèi)含子和外顯子間保守的剪接位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變,導(dǎo)致該基因無(wú)法被正常的剪接,不能轉(zhuǎn)錄成成熟的mRNA,蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程也被終止。感光視蛋白與11-順式視黃醛結(jié)合形成視錐細(xì)胞中的感光色素,由于基因突變致使蛋白無(wú)法合成,錐體細(xì)胞感光后的感光換能機(jī)制受到了抑制,所以在視覺(jué)電生理學(xué)檢測(cè)中顯示為無(wú)法檢測(cè)到錐體細(xì)胞的功能,表現(xiàn)為明適應(yīng)下無(wú)任何波形。中波長(zhǎng)視蛋白基因的突變會(huì)導(dǎo)致綠色盲或者綠色弱疾病的產(chǎn)生,所以模式大鼠為綠色色覺(jué)異常大鼠。 迄今為止發(fā)現(xiàn)的中波長(zhǎng)視蛋白基因的突變或是由于基因重組,或是由于外顯子中的點(diǎn)突變引起,而該基因內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)突變屬于首例,這為研究中波長(zhǎng)視蛋白基因的功能、結(jié)構(gòu)等方面提供了更多的機(jī)遇。藍(lán)色錐體全色盲(blue cone monochromatism,BCM)疾病表現(xiàn)為感紅(長(zhǎng)波長(zhǎng))和感綠(中波長(zhǎng))錐體細(xì)胞功能喪失,而感藍(lán)(短波長(zhǎng))錐體細(xì)胞和視桿細(xì)胞的功能正常。由于大鼠中只存在感綠(中波長(zhǎng))和感藍(lán)(短波長(zhǎng))兩種錐體細(xì)胞,所以,本模式大鼠可能為國(guó)際首例發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變BCM模式動(dòng)物,因此具有重要的研究意義。同時(shí),光學(xué)顯微鏡和全視網(wǎng)膜鋪片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模式大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變,光感受器細(xì)胞層的厚度及錐體細(xì)胞的數(shù)量并未發(fā)生明顯變化,這為研究色覺(jué)異常機(jī)制、視網(wǎng)膜信號(hào)回路及基因治療色覺(jué)異常疾病提供了理想的動(dòng)物模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2442711