【摘要】：隨著真菌感染疾病的增多，人類對真菌病的認識不斷提高，研究逐步深入，真菌性鼻-鼻竇炎日益受到關(guān)注。真菌性鼻-鼻竇炎是指真菌在鼻腔、鼻竇內(nèi)引起的一種感染性或(和)變應(yīng)性疾病。根據(jù)組織受侵犯的臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)不同，分為非侵襲性和侵襲性兩大類型。所謂侵襲性真菌性鼻竇炎（Invasive FungalRhinosinusitis, IFRS）屬于侵襲性真菌感染，是指真菌菌絲侵入黏膜、黏膜下、血管、骨質(zhì)等組織結(jié)構(gòu)中，而非侵襲性真菌性鼻竇炎真菌菌絲聚集在竇腔，未侵入黏膜及深部組織，兩者在臨床表現(xiàn)和預(yù)后方面差異很大，特別是急性侵襲性真菌性鼻竇炎病情兇險，病人可在數(shù)日內(nèi)由于真菌侵襲性損害而死亡。 各種環(huán)境因素及宿主因素與真菌性鼻竇炎的發(fā)病有關(guān)，其中機體免疫功能狀態(tài)與真菌性鼻竇炎的病理分型有關(guān)，當免疫功能不足時，易患侵襲性真菌性鼻竇炎。骨髓移植和器官移植的接受者、未經(jīng)控制血糖的糖尿病患者和艾滋病感染者都是侵襲性鼻竇炎的高危人群。煙曲霉菌是真菌性鼻竇炎最常見條件致病菌，煙曲霉菌可分泌許多胞外蛋白酶，如堿性蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等，這些酶之間協(xié)同作用，造成組織的破壞和侵襲。在煙曲霉分泌的許多蛋白酶中，絲氨酸蛋白酶分泌量高，發(fā)揮重要的毒力作用。 近年的突破性研究表明，乳腺絲氨酸蛋白酶抑制（mammary serine proteinaseinhibitor,Maspin），在抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。在前列腺癌晚期時局部炎癥活化IκB激酶-α（IκB kinase-α，IKKα)，繼而下調(diào)maspin蛋白的表達，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。侵襲性真菌性鼻-鼻竇炎病變向周圍組織擴散的進程與惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程具有相似性，在侵襲性真菌性鼻竇炎時maspin是否也參與了病變的侵襲和擴散，其炎癥組織中是否有IKKα的活化及其介導(dǎo)的maspin下調(diào)呢？而且真菌侵襲的主要致病毒素之一即為絲氨酸蛋白酶，而maspin恰恰是絲氨酸蛋白酶的抑制劑，探討maspin與真菌侵襲的關(guān)系有重要的臨床意義。 本課題共分3部分，將應(yīng)用體外細胞學(xué)的方法，觀察真菌誘導(dǎo)呼吸道上皮IKKα、maspin蛋白表達下調(diào)；建立侵襲性真菌性鼻竇炎動物模型；在活體動物實驗的條件下，侵襲性真菌性鼻竇炎發(fā)病中maspin與IKKα的表達情況。 第一部分 煙曲霉菌誘導(dǎo)大鼠呼吸道上皮細胞IKKα調(diào)控maspin表達的初步研究 目的研究煙曲霉誘導(dǎo)呼吸道上皮細胞時是否存在IκB激酶-α（IκB kinase-α，IKKα）調(diào)控maspin蛋白表達下調(diào)。 方法體外培養(yǎng)大鼠呼吸道上皮細胞(REC)，制備滅活的煙曲霉絲(AFH)懸液誘導(dǎo)REC細胞，以PBS緩沖液為對照，采用RT-PCR技術(shù)檢測REC中maspin基因的表達，并通過免疫細胞化學(xué)技術(shù)觀察maspin蛋白及IKKα在REC的表達情況。進一步制備濃度依次增高的AFH1～3懸液誘導(dǎo)REC細胞，Western Blot技術(shù)檢測REC的maspin和IKKα蛋白表達，應(yīng)用方差分析和兩變量的相關(guān)性分析統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)。 結(jié)果RT-PCR檢測顯示AFH組與對照組的maspin蛋白的mRNA相對表達量分別為0.128±0.059和2.972±0.353，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.883P＜0.05）。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，maspin蛋白在兩組中均表達，其中AFH組呈弱陽性，而對照組呈中度陽性，綜合計分兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.721P＜0.05）；IKKα顯色，AFH組中度陽性，對照組弱陽性，綜合計分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.825P＜0.05）。Western Blot結(jié)果maspin與β-actin的灰度比值對照組為0.912±0.023，AFH1～3組分別為0.607±0.030、0.476±0.019、0.416±0.017，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=281.91，P＜0.05），且任兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；IKKα與β-actin灰度比值對照組為0.624±0.012，AFH1～3組分別為0.739±0.020、0.778±0.010、0.927±0.017，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=200.91，P＜0.05），且任兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。兩變量相關(guān)性分析結(jié)果，maspin蛋白表達與IKKα蛋白表達呈負相關(guān)關(guān)系（r=－0.911，P＜0.05）。 結(jié)論煙曲霉誘導(dǎo)大鼠呼吸上皮細胞IKKα表達上調(diào)并伴有maspin蛋白表達下調(diào)。應(yīng)用體外細胞學(xué)的方法，觀察真菌誘導(dǎo)呼吸道上皮IKKα、maspin mRNA及其蛋白表達下調(diào),以便探尋侵襲性真菌性鼻竇炎的侵襲機制。 第二部分 建立免疫抑制大鼠侵襲性真菌性鼻竇炎動物模型的實驗研究 目的鑒于國內(nèi)外侵襲性真菌性鼻-鼻竇炎動物模型報道極少的情況，本實驗旨探索建立侵襲性真菌性鼻-鼻竇炎的動物模型的方法。 方法本實驗按照臨床侵襲性真菌性鼻竇炎的發(fā)病特點，以50只健康Wistar大鼠為實驗動物，利用Merocel棉鼻腔填塞導(dǎo)致上頜竇竇口阻塞，應(yīng)用環(huán)磷酰胺作為免疫抑制，煙曲霉孢子懸液鼻腔導(dǎo)入的方法建立侵襲性真菌性鼻竇炎的模型。實驗分5組，分別是空白對照組、單純鼻塞組、鼻塞加真菌組、鼻塞加免疫抑制組、侵襲性真菌鼻竇炎組。通過大體觀察、檢查白細胞數(shù)及血清半乳甘露聚糖、組織真菌培養(yǎng)和病理學(xué)檢查來確定各組的發(fā)病情況。 結(jié)果大體觀察結(jié)果表明，本實驗中大鼠鼻塞后出現(xiàn)打噴嚏及撓鼻增多，體重增加速度減緩。鼻塞加免疫抑制組和侵襲性真菌鼻竇炎組第7天大鼠注射環(huán)磷酰胺后開始，大鼠開始出現(xiàn)毛發(fā)不榮，食量及飲水量減少，體重下降明顯。侵襲性真菌鼻竇炎組第11天真菌導(dǎo)入后有血涕現(xiàn)象，結(jié)膜充血，2只大鼠氣喘紫紺，1只偏癱；而鼻塞加真菌組第11天真菌導(dǎo)入后體重未見下降，無結(jié)膜充血，無氣喘紫紺現(xiàn)象。第18天前侵襲性真菌鼻竇炎組死亡2只，而其余各組在18天未見死亡。 實驗檢測結(jié)果表明，鼻塞對大鼠中性粒細胞計數(shù)無影響，鼻塞加真菌促使大鼠中性粒細胞計數(shù)顯著增加，而鼻塞加腹腔注射環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致大鼠中性粒細胞顯著下降（低于0.5×109/L）。侵襲性真菌鼻竇炎組血清半乳甘露聚糖較其他組升高（P＜0.05）。侵襲性真菌鼻竇炎組的組織勻漿真菌培養(yǎng)陽性率鼻竇和肺組織分別為62.5%和25%，而其他組組織勻漿真菌培養(yǎng)為陰性結(jié)果。病理學(xué)檢查見侵襲性真菌性鼻竇炎組病變可見大量菌絲，真菌侵犯血管，引起血管炎、血管栓塞、骨質(zhì)破壞和組織壞死等，而其他組大鼠未見符合侵襲性真菌性鼻竇炎的病理改變的特征。 結(jié)論本實驗探索了建模的程序、鼻塞及用免疫抑制藥的時機，真菌侵入的條件，成功建立大鼠侵襲性真菌性鼻竇炎的動物模型。 第三部分 大鼠侵襲性真菌性鼻竇炎IKKα調(diào)控maspin蛋白表達的實驗研究 目的本課題前期體外細胞學(xué)實驗研究結(jié)果提示，呼吸道上皮細胞存在煙曲霉刺激下的IKKα誘導(dǎo)maspin mRNA及其蛋白表達下調(diào)。本實驗旨在探討在活體動物實驗的條件下，侵襲性真菌性鼻竇炎發(fā)病中maspin與IKKα的表達情況。 方法建立大鼠侵襲性真菌性鼻竇炎動物模型，以空白對照組、單純鼻塞組、鼻塞加真菌組、鼻塞加免疫抑制組大鼠為對照，通過組織真菌培養(yǎng)和病理學(xué)檢查來檢測各組的發(fā)病情況，應(yīng)用ELISA法檢測大鼠血清TNFα濃度，采用免疫組化染色技術(shù)、RT-PCR技術(shù)、Western Blot雜交技術(shù)，檢測大鼠鼻竇粘膜組織maspin及IKKα表達的情況。 結(jié)果ELISA法檢測大鼠血清TNFα濃度，組間比較方差分析F=26.78P0.05，各組TNFα濃度不同。其中鼻塞加真菌組大鼠血清TNFα濃度最高，與其他組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。鼻塞加免疫抑制組和侵襲性真菌性鼻竇炎組血清TNFα濃度最低，與其他各組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 免疫組化染色技術(shù)以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分，各組的maspin染色評分結(jié)果組間比較方差分析F=14.58(P0.05)，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中侵襲性真菌鼻竇炎組評分最低，與其他各組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。IKKα染色評分結(jié)果組間比較方差分析F=18.80(P0.05)，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中鼻塞加真菌組、侵襲性真菌性鼻竇炎組評分較高與分別與其他各組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05）。 RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果，， maspin的mRNA相對表達量組間比較方差分析F=13.678(Ｐ0.05)，可見各組maspin的mRNA相對表達量不同。其中侵襲性真菌鼻竇炎組最低，且與其他各組比較，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 Western Blot雜交技術(shù)結(jié)果maspin／β-actin灰度比值組間比較方差分析F=6.976(P0.05)，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中侵襲性真菌鼻竇炎組maspin相對表達量最低，且與其他各組比較，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組IKKα／β-actin灰度比值組間比較方差分析F=18.156(P0.05)，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，鼻塞加真菌組和侵襲性真菌性鼻竇炎組IKKα蛋白相對表達量較高，和其他各組兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論在體實驗研究情況下，不存在IKKα活化--maspin下調(diào)的簡單的線性關(guān)系。免疫功能正常的情況下，真菌侵襲IKKα活化但未見maspin下調(diào)；而在免疫功能缺陷的情況下真菌侵襲IKKα活化促進了maspin下調(diào)。 結(jié)論 1、體外細胞培養(yǎng)的條件下，大鼠呼吸道上皮存在煙曲霉介導(dǎo)的IKKα活化和maspin的表達下調(diào)； 2、按照臨床侵襲性真菌性鼻竇炎的發(fā)病特點，借鑒細菌性鼻竇炎的成功經(jīng)驗，應(yīng)用環(huán)磷酰胺為免疫抑制劑，在鼻塞的基礎(chǔ)上真菌侵入，成功探索構(gòu)建大鼠侵襲性真菌性鼻竇炎的動物模型的方法。 3、在體動物實驗研究的條件下，免疫功能正常，煙曲霉刺激IKKα活化，未見maspin下調(diào)，而侵襲性真菌性鼻竇炎在免疫功能缺陷的情況下煙曲霉刺激IKKα活化促進了maspin下調(diào)。 4、本課題的創(chuàng)新之處在于首次探討maspin蛋白及IKKα與侵襲真菌病發(fā)病的關(guān)系,揭示了IKKα活化介導(dǎo)的maspin蛋白下調(diào)是侵襲性真菌性鼻竇炎侵襲的重要的分子機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R765.41

【參考文獻】

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本文編號：2437210