【摘要】：研究背景及目的 惡性腫瘤對人類健康造成嚴重的威脅。侵襲性生長方式和遠處轉(zhuǎn)移性生長往往引起腫瘤原發(fā)灶以外的播散,也是影響預后的重要因素。研究表明,惡性腫瘤細胞侵襲性生長的特性由多種因素調(diào)控。因此,揭示這些惡性侵襲機制對于腫瘤的基礎研究和臨床治療方式選擇具有非常重要的意義。 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種全球分布具有顯著區(qū)域性的惡性腫瘤,西方國家較為少見。在南部中國和東南亞洲有較高的發(fā)病率,年發(fā)病率約為20例/10萬人。每年全球新發(fā)病例約8萬人,死亡人數(shù)約5萬人。鼻咽癌發(fā)病機制非常復雜,包括病毒感染,基因不穩(wěn)定和環(huán)境因素。目前公認為EB病毒感染對地方性和非地方性鼻咽癌的發(fā)病具有重要作用。EB病毒最初在鼻咽癌患者血清中被發(fā)現(xiàn),繼而人們又在鼻咽癌細胞中發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA和核抗原,進一步確證了EB病毒與鼻咽癌發(fā)病關系密切。研究證實針對EB病毒的衣殼抗原(VCA)的抗體鑒定和患者血漿EB病毒DNA檢出對鼻咽癌的預后具有價值。但是近來多項研究發(fā)現(xiàn)這種預后評判仍然不具穩(wěn)定性,而且臨床應用價值仍有待考證。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)多種信號分子在鼻咽癌細胞中表達異常,包括信號受體如表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換因子(c-MET),以及胞內(nèi)有絲分裂信號通路PI3K/AKT/mTOR的抑制、缺氧誘導因子la(HIF-1a)的表達異常 人肝素酶(Heparanase, Hpa)是一種內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶。他具有能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜中乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)的功能。在骨骼肌、胰腺、肝臟、心及肺等正常組織中極少表達,但是在幾乎所有的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞中廣泛高表達。研究證實,肝素酶能夠誘導腫瘤血管生成、增強腫瘤侵襲特性和促進轉(zhuǎn)移。相反,抑制了肝素酶的表達則能夠明顯降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。正因如此,肝素酶目前已經(jīng)成為一種在基因治療研究中較受關注的腫瘤特異性靶點。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指小分子非編碼RNA(siRNA)在轉(zhuǎn)錄后導致基因沉默(Gene Silencing)的效應[19-20]。目前被廣泛運用為基因沉默工具。siRNA沉默基因的原理是通過與互補序列mRNA的特異結(jié)合,促使靶基因降解。RNAi技術(shù)近年來發(fā)展非常迅速,2001年《Science》雜志報道了siRNA能夠特異性的沉默哺乳動物細胞基因后[21-22],RNA干擾逐漸成為生物醫(yī)學研究中的一項重要的實驗工具,作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默手段已經(jīng)在腫瘤、慢性疾病及感染性疾病的治療中顯示出巨大潛力及應用前景。 本實驗擬通過RNAi技術(shù)抑制Hpa在CNE-2鼻咽癌細胞中的表達,并研究沉默Hpa后的CNE-2細胞在腫瘤的生長、侵襲變化情況,為Hpa在作為鼻咽癌基因治療中的作用提供實驗室依據(jù)。 研究方法 1.采用免疫組織化學檢測鼻咽癌原發(fā)灶及同一病例癌旁正常組織內(nèi)的Hpa表達情況,并采用免疫細胞化學法檢測鼻咽癌細胞株CNE-2中Hpa的表達情況。 2.在Genebank中查找人肝素酶mRNA序列片段,應用網(wǎng)絡在線工具設計Hpa的干擾序列,并設計干擾序列的dsDNA并進行生物合成；雙酶切母體質(zhì)粒pGenesil-1;將人工合成的dsDNA采用基因克隆的方式裝載至酶切后的質(zhì)粒中,并測序鑒定和擴增備用。 3.培養(yǎng)鼻咽癌細胞株CNE-2,用Lipofectamine將重組干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染進CNE-2細胞；經(jīng)過抗生素G418篩選4周；從殘存細胞中挑取單個細胞克隆,擴大培養(yǎng)并備用。 4.RT-PCR檢測單克隆CNE-2中Hpa的RNA表達；以及Western blot檢測單克隆CNE-2細胞中Hpa蛋白的表達水平,通過對比未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CNE-2細胞,確定干擾質(zhì)粒對CNE-2細胞內(nèi)肝素酶表達的影響。 5.采用MTT試驗和Transwell體外侵襲試驗檢測RNA干擾肝素酶后CNE-2細胞增殖生長能力、侵襲能力的抑制程度。 實驗結(jié)果 1.免疫組織化學檢測鼻咽癌原發(fā)灶及同一病例癌旁正常組織內(nèi)的Hpa表達發(fā)現(xiàn),鼻咽癌原發(fā)灶內(nèi)有顯著的Hpa蛋白表達,而同一病例癌旁正常組織內(nèi)無Hpa表達；同時免疫細胞化學法檢測鼻咽癌細胞株CNE-2,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)有較高水平的Hpa表達。 2.采用www.genscript.com網(wǎng)站的在線設計工具查找肝素酶干擾序列多條,經(jīng)在線篩選原則篩選后確定得分最高的一條；合成該條干擾序列的dsDNA,并將dsDNA克隆至干擾載體質(zhì)粒pGenesil-1,經(jīng)測序鑒定后,命名為pGenesil/Hpa 2.采用Lipofectamine法將pGenesil/Hpa轉(zhuǎn)染至CNE-2鼻咽癌中,采用G418壓力篩選后,得到單個細胞克隆,并擴大培養(yǎng)后細胞亞株命名為CNE-2/Hpa-。 3. RT-PCR結(jié)果表明,干擾組CNE-2/Hpa-中Hpa的mRNA表達水平相對CNE-2顯著降低；Western blot檢測結(jié)果證實CNE-2/Hpa-中Hpa蛋白表達水平較CNE-2組顯著降低,抑制效率分別達到78.7%。 4.MTT實驗證實CNE-2/Hpa-組細胞增殖能力顯著弱于CNE-2; Transwell體外穿透實驗證實,CNE-2/Hpa-細胞穿透基質(zhì)膠膜能力較CNE-2細胞顯著減弱(113±13vs26±5)。 結(jié)論 1.免疫組織化學證實Hpa在鼻咽癌原發(fā)灶內(nèi)高表達,而在同一病例癌旁正常組織內(nèi)無表達；同時免疫細胞化學法證實Hpa在鼻咽癌細胞株CNE-2內(nèi)高表達。 2.通過在線生物信息學方法,篩選獲得1條人肝素酶RNA干擾序列；通過DNA重組方法,成功構(gòu)建肝素酶RNAi載體；通過Lipofectamine轉(zhuǎn)染及G418篩選,成功獲得穩(wěn)定表達肝素酶RNAi質(zhì)粒的單個細胞克隆；通過Realtime Time PCR和Western blot方法,證實該干擾序列可以有效地抑制CNE-2鼻咽癌細胞內(nèi)肝素酶的表達。 3.體外實驗顯示,經(jīng)過有效干擾Hpa后的CNE-2鼻咽癌細胞在細胞擴增速率、體外穿膜能力等方面均較對照CNE-2鼻咽癌細胞組顯著降低。 以上研究表明,肝素酶在鼻咽癌細胞的細胞生長增殖和侵襲行為中扮演重要角色；我們構(gòu)建的人肝素酶干擾序列能有效抑制鼻咽癌的細胞體外增殖和運動侵襲能力,為肝素酶RNA干擾在中晚期鼻咽癌中的治療作用提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2431377