【摘要】：研究背景及目的 惡性腫瘤對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的威脅。侵襲性生長方式和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性生長往往引起腫瘤原發(fā)灶以外的播散,也是影響預(yù)后的重要因素。研究表明,惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性生長的特性由多種因素調(diào)控。因此,揭示這些惡性侵襲機(jī)制對(duì)于腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床治療方式選擇具有非常重要的意義。 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種全球分布具有顯著區(qū)域性的惡性腫瘤,西方國家較為少見。在南部中國和東南亞洲有較高的發(fā)病率,年發(fā)病率約為20例/10萬人。每年全球新發(fā)病例約8萬人,死亡人數(shù)約5萬人。鼻咽癌發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,包括病毒感染,基因不穩(wěn)定和環(huán)境因素。目前公認(rèn)為EB病毒感染對(duì)地方性和非地方性鼻咽癌的發(fā)病具有重要作用。EB病毒最初在鼻咽癌患者血清中被發(fā)現(xiàn),繼而人們又在鼻咽癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA和核抗原,進(jìn)一步確證了EB病毒與鼻咽癌發(fā)病關(guān)系密切。研究證實(shí)針對(duì)EB病毒的衣殼抗原(VCA)的抗體鑒定和患者血漿EB病毒DNA檢出對(duì)鼻咽癌的預(yù)后具有價(jià)值。但是近來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)這種預(yù)后評(píng)判仍然不具穩(wěn)定性,而且臨床應(yīng)用價(jià)值仍有待考證。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)分子在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)異常,包括信號(hào)受體如表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換因子(c-MET),以及胞內(nèi)有絲分裂信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR的抑制、缺氧誘導(dǎo)因子la(HIF-1a)的表達(dá)異常 人肝素酶(Heparanase, Hpa)是一種內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶。他具有能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)的功能。在骨骼肌、胰腺、肝臟、心及肺等正常組織中極少表達(dá),但是在幾乎所有的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中廣泛高表達(dá)。研究證實(shí),肝素酶能夠誘導(dǎo)腫瘤血管生成、增強(qiáng)腫瘤侵襲特性和促進(jìn)轉(zhuǎn)移。相反,抑制了肝素酶的表達(dá)則能夠明顯降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。正因如此,肝素酶目前已經(jīng)成為一種在基因治療研究中較受關(guān)注的腫瘤特異性靶點(diǎn)。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指小分子非編碼RNA(siRNA)在轉(zhuǎn)錄后導(dǎo)致基因沉默(Gene Silencing)的效應(yīng)[19-20]。目前被廣泛運(yùn)用為基因沉默工具。siRNA沉默基因的原理是通過與互補(bǔ)序列mRNA的特異結(jié)合,促使靶基因降解。RNAi技術(shù)近年來發(fā)展非常迅速,2001年《Science》雜志報(bào)道了siRNA能夠特異性的沉默哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因后[21-22],RNA干擾逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究中的一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)工具,作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默手段已經(jīng)在腫瘤、慢性疾病及感染性疾病的治療中顯示出巨大潛力及應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)擬通過RNAi技術(shù)抑制Hpa在CNE-2鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),并研究沉默Hpa后的CNE-2細(xì)胞在腫瘤的生長、侵襲變化情況,為Hpa在作為鼻咽癌基因治療中的作用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 研究方法 1.采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)鼻咽癌原發(fā)灶及同一病例癌旁正常組織內(nèi)的Hpa表達(dá)情況,并采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2中Hpa的表達(dá)情況。 2.在Genebank中查找人肝素酶mRNA序列片段,應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)在線工具設(shè)計(jì)Hpa的干擾序列,并設(shè)計(jì)干擾序列的dsDNA并進(jìn)行生物合成；雙酶切母體質(zhì)粒pGenesil-1;將人工合成的dsDNA采用基因克隆的方式裝載至酶切后的質(zhì)粒中,并測(cè)序鑒定和擴(kuò)增備用。 3.培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2,用Lipofectamine將重組干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)CNE-2細(xì)胞；經(jīng)過抗生素G418篩選4周；從殘存細(xì)胞中挑取單個(gè)細(xì)胞克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)并備用。 4.RT-PCR檢測(cè)單克隆CNE-2中Hpa的RNA表達(dá)；以及Western blot檢測(cè)單克隆CNE-2細(xì)胞中Hpa蛋白的表達(dá)水平,通過對(duì)比未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CNE-2細(xì)胞,確定干擾質(zhì)粒對(duì)CNE-2細(xì)胞內(nèi)肝素酶表達(dá)的影響。 5.采用MTT試驗(yàn)和Transwell體外侵襲試驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾肝素酶后CNE-2細(xì)胞增殖生長能力、侵襲能力的抑制程度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)鼻咽癌原發(fā)灶及同一病例癌旁正常組織內(nèi)的Hpa表達(dá)發(fā)現(xiàn),鼻咽癌原發(fā)灶內(nèi)有顯著的Hpa蛋白表達(dá),而同一病例癌旁正常組織內(nèi)無Hpa表達(dá)；同時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)有較高水平的Hpa表達(dá)。 2.采用www.genscript.com網(wǎng)站的在線設(shè)計(jì)工具查找肝素酶干擾序列多條,經(jīng)在線篩選原則篩選后確定得分最高的一條；合成該條干擾序列的dsDNA,并將dsDNA克隆至干擾載體質(zhì)粒pGenesil-1,經(jīng)測(cè)序鑒定后,命名為pGenesil/Hpa 2.采用Lipofectamine法將pGenesil/Hpa轉(zhuǎn)染至CNE-2鼻咽癌中,采用G418壓力篩選后,得到單個(gè)細(xì)胞克隆,并擴(kuò)大培養(yǎng)后細(xì)胞亞株命名為CNE-2/Hpa-。 3. RT-PCR結(jié)果表明,干擾組CNE-2/Hpa-中Hpa的mRNA表達(dá)水平相對(duì)CNE-2顯著降低；Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)CNE-2/Hpa-中Hpa蛋白表達(dá)水平較CNE-2組顯著降低,抑制效率分別達(dá)到78.7%。 4.MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)CNE-2/Hpa-組細(xì)胞增殖能力顯著弱于CNE-2; Transwell體外穿透實(shí)驗(yàn)證實(shí),CNE-2/Hpa-細(xì)胞穿透基質(zhì)膠膜能力較CNE-2細(xì)胞顯著減弱(113±13vs26±5)。 結(jié)論 1.免疫組織化學(xué)證實(shí)Hpa在鼻咽癌原發(fā)灶內(nèi)高表達(dá),而在同一病例癌旁正常組織內(nèi)無表達(dá)；同時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)Hpa在鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2內(nèi)高表達(dá)。 2.通過在線生物信息學(xué)方法,篩選獲得1條人肝素酶RNA干擾序列；通過DNA重組方法,成功構(gòu)建肝素酶RNAi載體；通過Lipofectamine轉(zhuǎn)染及G418篩選,成功獲得穩(wěn)定表達(dá)肝素酶RNAi質(zhì)粒的單個(gè)細(xì)胞克�。煌ㄟ^Realtime Time PCR和Western blot方法,證實(shí)該干擾序列可以有效地抑制CNE-2鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)肝素酶的表達(dá)。 3.體外實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)過有效干擾Hpa后的CNE-2鼻咽癌細(xì)胞在細(xì)胞擴(kuò)增速率、體外穿膜能力等方面均較對(duì)照CNE-2鼻咽癌細(xì)胞組顯著降低。 以上研究表明,肝素酶在鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞生長增殖和侵襲行為中扮演重要角色；我們構(gòu)建的人肝素酶干擾序列能有效抑制鼻咽癌的細(xì)胞體外增殖和運(yùn)動(dòng)侵襲能力,為肝素酶RNA干擾在中晚期鼻咽癌中的治療作用提供了理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2431377