【摘要】：研究目的： 本研究擬對一先天性特殊表型白內(nèi)障大家系進行疾病相關(guān)候選基因的定位及目標(biāo)基因體外克隆,通過對蛋白定位、縫隙連接半通道功能及縫隙連接通道功能的檢測,探究該突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障發(fā)生的機制。 研究方法： 基因篩查部分：收集一先天性遺傳性白內(nèi)障家系,所有家族成員接受眼部裂隙燈檢查,抽取外周血樣本,提取基因組DNA。白內(nèi)障術(shù)中收集患者前囊膜及晶狀體樣本,制作電鏡標(biāo)本并觀察晶狀體超微結(jié)構(gòu)改變。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增與該家系表型相關(guān)的候選基因并進行序列分析。以100位健康中國人基因組DNA為陰性對照。根據(jù)上述結(jié)果,運用Antheprot4.3和Swiss-model軟件對野生組及突變組蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)進行分析。 基因功能研究部分：從人晶狀體cDNA文庫中獲得GJA8基因,克隆并重組至pEGFP-N1質(zhì)粒中,構(gòu)建野生型質(zhì)粒Cx50-EGFP。利用定點突變技術(shù),構(gòu)建突變型質(zhì)粒Cx50V44A-EGFP。野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒及空白質(zhì)粒(pEGFP-N1)分別轉(zhuǎn)染Hek-293細胞,利用G418篩選,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒的細胞系。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中觀察蛋白定位及縫隙連接形成。在低鈣、生理鈣及Connexin通道抑制劑環(huán)境下,運用極性染料染核技術(shù)及膜片鉗技術(shù),檢測各組細胞半通道功能區(qū)別。在生理鈣環(huán)境下,利用單細胞注射及染料彌散試驗,檢測各組細胞縫隙連接通道功能區(qū)別。 研究結(jié)果： 該家系患者白內(nèi)障表型為核性混濁,但不累及“Y”字縫,不伴有其他眼部或系統(tǒng)性疾病,遺傳方式為常染色體顯性遺傳�；驕y序發(fā)現(xiàn)該家系患者GJA8基因cDNA第131位堿基胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(c.131TC),該突變導(dǎo)致GJA8基因所表達Cx50蛋白的44位氨基酸由纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?p.V44A),而在家系正常人及100個中國正常漢族人中均未發(fā)現(xiàn)該突變。成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cx50-EGFP、 Cx50V44A-EGFP、pEGFP-N1質(zhì)粒的Hek293細胞系。在野生組細胞及突變組細胞中皆觀察到縫隙連接的形成,數(shù)量上無統(tǒng)計學(xué)差異。在半通道功能檢測中,低鈣環(huán)境下,野生組細胞可攝取DAPI和PI兩種染料,而突變組及空白組細胞不能攝�。欢谏礅}和Cx通道抑制劑環(huán)境下,三組細胞皆不能攝取染料。全細胞膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)低鈣環(huán)境下野生組細胞表面電流顯著高于突變組細胞�？p隙連接通道功能檢測中,4%neurobiotin可在野生組及突變組細胞中彌散,而5%Lucifer yellow僅在野生組細胞中彌散。 研究結(jié)論： 本研究首次發(fā)現(xiàn)GJA8基因c.131TC突變導(dǎo)致一特殊表型先天性白內(nèi)障的發(fā)生,其表型為核性渾濁但不累及“Y”字縫。基因功能研究發(fā)現(xiàn)Connexin50蛋白V44A突變不影響細胞中縫隙連接的表達,但影響縫隙連接半通道及縫隙連接通道的開放,通道功能改變直接導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。
[Abstract]:Objective: the aim of this study is to locate the disease-related candidate genes and to clone the target genes in vitro in order to locate the proteins in a congenital special phenotypic cataract family. Detection of gap junction half-channel function and gap junction channel function to explore the mechanism of congenital cataract caused by this mutation. Methods: gene screening: a family with congenital cataract was collected. All family members underwent eye slit lamp examination, peripheral blood samples were taken and genomic DNA. was extracted. The anterior capsule and lens samples were collected, and the ultrastructural changes of lens were observed. The candidate genes associated with phenotypes of the family were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and sequenced. A total of 100 healthy Chinese were used as negative controls for genomic DNA. According to the above results, the secondary structure and tertiary structure of wild and mutant histone were analyzed by Antheprot4.3 and Swiss-model software. Gene function research: GJA8 gene was obtained from human lens cDNA library, cloned and recombined into pEGFP-N1 plasmid to construct wild type plasmid Cx50-EGFP.. Construction of Mutant plasmid Cx50V44A-EGFP. by site-directed Mutagenesis Wild-type plasmid, mutant plasmid and blank plasmid (pEGFP-N1) were transfected into Hek-293 cells respectively. The cell lines stably transfected with each group of plasmids were obtained by G418 screening. Protein localization and gap junction formation were observed in stable transfected cells. Under the condition of low calcium, physiological calcium and Connexin channel inhibitor, polar dye staining and patch clamp technique were used to detect the difference of half-channel function in each group. In physiological calcium environment, single cell injection and dye diffusion test were used to detect the function difference of gap junctional channels in each group. Results: the cataract phenotype of this family is nuclear opacification, but does not involve the "Y" suture, without other eye diseases or systemic diseases, the genetic pattern is autosomal dominant inheritance. Gene sequencing revealed that thymine was converted into cytosine (c.131TC) at position 131 of GJA8 gene cDNA in this family. The mutation resulted in the conversion of 44 amino acids of Cx50 protein expressed in GJA8 gene from valine to alanine (p.V44A). However, the mutation was not found in 100 Chinese normal Chinese and normal controls. A Hek293 cell line stably transfected with Cx50-EGFP, Cx50V44A-EGFP,pEGFP-N1 plasmid was successfully established. Gap junctions were observed in wild cells and mutant cells, and there was no significant difference in the number of gap junctions. In the half-channel function test, the wild group cells could absorb DAPI and PI dyes in low calcium environment, but the mutant group and blank group cells could not, while in the physiological calcium and Cx channel inhibitor environment, all the three groups cells could not absorb the dyes. Whole-cell patch clamp assay showed that the cell surface current in wild group was significantly higher than that in mutant group in low calcium environment. In the detection of gap junction channel function, 4%neurobiotin was diffused in wild group and mutant group, while 5%Lucifer yellow was only diffused in wild group. Conclusion: in this study, we first found that the c.131TC mutation of GJA8 gene leads to a special phenotype of congenital cataract, which is nuclear turbid but does not involve the "Y" suture. Gene function studies showed that the mutation of Connexin50 protein V44A did not affect the expression of gap junctions, but affected the opening of gap junction half-channel and gap junction channel, and the alteration of channel function directly led to the occurrence of congenital cataract.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R776.1

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金海霞;魏南珠;劉正明;趙艷;胡善萌;陳義;;丹參粉針劑合20%甘露醇治療外傷性前房積血療效觀察[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2009年01期

2 劉慧霞;高平;張康玉;邢丹紅;;絲裂霉素C聯(lián)合自體角膜緣干細胞移植治療翼狀胬肉[J];安徽醫(yī)學(xué);2009年08期

3 王冬梅;施曉江;;改良式額肌腱膜提吊術(shù)矯治先天性上瞼下垂[J];安徽醫(yī)學(xué);2010年12期

4 殷艷;穆燕;;醫(yī)用水凝膠護眼貼預(yù)防全麻術(shù)后暴露性角膜炎療效觀察[J];安徽醫(yī)學(xué);2011年02期

5 徐躍里;沈建國;;淚道激光成形術(shù)治療淚道阻塞60例效果分析[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年10期

6 李哲清;洪梅;方麗;;曲伏前列素治療超聲乳化聯(lián)合房角分離術(shù)后的閉角型青光眼[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2012年03期

7 李瑞鳳;劉桂香;;不同注視性質(zhì)弱視治愈前后立體視的變化[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年03期

8 杜誠;劉敬才;;玉屏風(fēng)散加減治療復(fù)發(fā)性HSK的療效觀察[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2010年02期

9 余其智;杜誠;劉敬才;;玉屏風(fēng)散對HSK外周血中CD_4、CD_8及其比值的影響[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2010年03期

10 周華生;;視力檢測反應(yīng)時間與視力及視力結(jié)果關(guān)系的探討[J];北京醫(yī)學(xué);2006年08期

相關(guān)會議論文 前9條

1 王小兵;趙世強;呂夢;劉愛珍;;人眼調(diào)節(jié)功能客觀檢查技術(shù)的初步應(yīng)用與評估[A];中國儀器儀表學(xué)會醫(yī)療儀器分會第四次全國會員代表大會暨2009年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2009年

2 劉娉;彭清華;姚小磊;;復(fù)明片對兔視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜組織中IL-1、MMP-2表達的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會第七次眼科學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2008年

3 陳梅;彭清華;;脈絡(luò)膜黑色素瘤伴視網(wǎng)膜脫離1例[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會第七次眼科學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2008年

4 彭華;馬珊;;加減涼血活血湯治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞的臨床觀察[A];全國第九次中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合眼科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2010年

5 林靜蘭;;復(fù)方血栓通膠囊治療年齡相關(guān)性黃斑變性伴黃斑出血的臨床觀察[A];全國第九次中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合眼科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2010年

6 李強;段俊國;張富文;;自發(fā)性糖尿病大鼠(GK大鼠)視網(wǎng)膜病變模型的評價[A];第九次全國中醫(yī)糖尿病學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2006年

7 許超;沈玲;任燕領(lǐng);;低濃度C3F8聯(lián)合玻璃體切除治療特發(fā)性黃斑前膜的療效觀察[A];河南省五官科專科護士培養(yǎng)及崗位管理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2013年

8 吉暉暉;秦二英;;全麻下開顱手術(shù)患者眼睛的護理方法探討[A];2012年河南省現(xiàn)代手術(shù)室護理安全暨管理學(xué)術(shù)交流會議論文集[C];2012年

9 湯鵬;張馨元;劉技輝;劉薇;梁宇光;關(guān)楠思;;不同刺激野的視覺誘發(fā)電位特征的研究[A];全國第九次法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 柳瓏;GEFT調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞分化的機制研究[D];湖南師范大學(xué);2011年

2 于靜;中醫(yī)睫狀體平坦部濾過術(shù)降眼壓療效安全性及其視神經(jīng)保護作用研究[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2011年

3 張華;中國傳統(tǒng)繪畫與視覺[D];西安美術(shù)學(xué)院;2011年

4 陳志祺;原發(fā)性開角型青光眼中樞形態(tài)學(xué)及功能學(xué)改變的MRI研究[D];華中科技大學(xué);2012年

5 趙梅生;真菌性眼內(nèi)炎的實驗研究[D];吉林大學(xué);2006年

6 張自峰;年齡相關(guān)性白內(nèi)障相關(guān)基因NDRG2和MRG15的功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

7 鄧志宏;胰島素樣生長因子-2對雞形覺剝奪性近視眼調(diào)控作用的研究[D];中南大學(xué);2006年

8 侯豹可;CNV大鼠視網(wǎng)膜—脈絡(luò)膜及缺氧人RPE細胞異常表達蛋白質(zhì)的篩選與鑒定[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2007年

9 劉卓;人眼晶狀體建模與仿真研究[D];國防科學(xué)技術(shù)大學(xué);2006年

10 陳宇虹;嬰幼兒型青光眼和青少年型青光眼的候選基因篩查和定位[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐為海;金雀異黃素對兔角膜堿燒傷新生血管的抑制作用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

2 楊翎;他克莫司對TGF-β誘導(dǎo)的人Tenon's囊成纖維細胞轉(zhuǎn)分化作用及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

3 張紅;Cx29、Cx30在出生后大鼠耳蝸不同發(fā)育階段的表達和意義[D];鄭州大學(xué);2010年

4 李毅男;糖尿病視網(wǎng)膜病變患者黃斑拱環(huán)結(jié)構(gòu)變化形態(tài)學(xué)分析[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

5 郭立濤;不同切口矯正白內(nèi)障超聲乳化摘除術(shù)前角膜散光的療效評價[D];承德醫(yī)學(xué)院;2010年

6 張淑榮;糖尿病并發(fā)眼表損害的病機特點研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

7 張敏;石斛夜光丸治療干眼的臨床觀察[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2010年

8 楊濤;原發(fā)性干燥綜合征眼表狀態(tài)及實驗室檢查相關(guān)性分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

9 梁玉耕;人工淚液聯(lián)合局部激素治療SS-ATD與NSS-ATD療效比較研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

10 韋琦;去整合素Kistrin對糖尿病兔后囊膜混濁過程中晶狀體上皮細胞增殖、Connexin43和Ⅳ型膠原表達的早期影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號：2431368