發(fā)布時(shí)間：2019-02-16 08:29

【摘要】：年齡相關(guān)性白內(nèi)障(Age-Related Cataract, ARC)，又稱老年性白內(nèi)障，是50歲及以上人群中開始發(fā)生的進(jìn)行性晶狀體混濁。盡管先進(jìn)的手術(shù)可以治療白內(nèi)障，但其目前仍是世界上引起低視力和盲的主要原因。 晶狀體上皮細(xì)胞（Lens Epithelial Cells, LECs）在晶狀體內(nèi)環(huán)境的維持和防御中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)晶狀體內(nèi)活性氧及其它自由基產(chǎn)生過多，超過其自身抗氧化清除能力時(shí)，氧化應(yīng)激可造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變和變性，DNA和線粒體損傷，最終引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。 Eph受體酪氨酸激酶A2（EphA2）是Eph亞族A類成員之一，位于1號(hào)染色體36區(qū)短臂，編碼976個(gè)氨基酸殘基的Ⅰ型膜蛋白，由胞外NH2末端區(qū)和胞內(nèi)COOH末端區(qū)構(gòu)成。近來發(fā)現(xiàn)，EphA2基因單核苷酸多態(tài)性與多種類型白內(nèi)障發(fā)生密切相關(guān)，然而其在白內(nèi)障發(fā)病中的具體機(jī)制仍尚不十分清楚。 為了探究EphA2基因在氧化應(yīng)激中的作用，，我們檢測(cè)經(jīng)不同濃度和時(shí)間過氧化氫處理的人晶狀體上皮細(xì)胞中的EphA2基因表達(dá)水平；構(gòu)建EphA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人的晶狀體上皮細(xì)胞中，觀察EphA2基因過表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞及過氧化氫誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響；為了進(jìn)一步探究EphA2基因表達(dá)水平與白內(nèi)障發(fā)病的相關(guān)性，我們檢測(cè)大鼠白內(nèi)障晶狀體、老齡和青年透明晶狀體中的EphA2基因表達(dá)水平的差異。 第一部分：氧化應(yīng)激對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞中的EphA2基因表達(dá)水平的影響 目的：觀察氧化應(yīng)激對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞（SRA01/04細(xì)胞）中的EphA2基因表達(dá)水平的影響。 方法：用不同濃度（0μM、50μM、100μM、200μM和300μM）H2O2處理SRA01/04細(xì)胞，24小時(shí)后用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。用H2O2（100μM和200μM）處理SRA01/04細(xì)胞24小時(shí)，建立急性氧化應(yīng)激模型。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)急性氧化應(yīng)激的SRA01/04細(xì)胞中的EphA2表達(dá)水平。用H2O2（50μM和100μM）處理SRA01/04細(xì)胞15天，建立慢性氧化應(yīng)激模型。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)慢性氧化應(yīng)激的SRA01/04細(xì)胞中的EphA2基因表達(dá)水平。 結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示，50μM H2O2對(duì)SRA01/04細(xì)胞存活率無明顯影響（P=0.357）；而H2O2在100-300μM范圍內(nèi)呈劑量依賴性降低SRA01/04細(xì)胞存活率。100μM和200μM H2O2處理SRA01/04細(xì)胞24h后，細(xì)胞中EphA2mRNA和蛋白表達(dá)水平呈明顯的升高。β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示：100μM處理組細(xì)胞染色陽(yáng)性百分比顯著高于50μM處理組（82±5.7%vs.19.2±7.3%，P=0.0000000004）。50μM H2O2處理SRA01/04細(xì)胞15天后，細(xì)胞中的EphA2mRNA和蛋白表達(dá)水平呈明顯升高；而100μM H2O2處理細(xì)胞15天后，SRA01/04細(xì)胞中的EphA2mRNA和蛋白表達(dá)水平呈明顯的下降。 結(jié)論：在H2O2誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激損傷過程中，可促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞中的EphA2基因的表達(dá)；而在慢性氧化應(yīng)激引起衰老的早期，可促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞中的EphA2基因表達(dá)；但隨著衰老程度的加重，則抑制SRA01/04細(xì)胞中的EphA2基因的表達(dá)。 第二部分：EphA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞系的研究 目的：驗(yàn)證構(gòu)建的EphA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒是否能夠在人晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)。 方法：以pBABE-puro-EphA2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增EphA2基因的cDNA；將EphA2cDNA克隆連接到真核表達(dá)載體（pIRES2-ZsGreen1）上；并行EcoRV和XhoI雙酶切鑒定質(zhì)粒及測(cè)序驗(yàn)證。利用Lipofectamine LTX將EphA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SRA01/04細(xì)胞中，于48h后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后SRA01/04細(xì)胞中的EphA2mRNA及蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：EphA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功且測(cè)序驗(yàn)證正確。LipofectamineLTX介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞的效率約為65%。EphA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞48h后，EphA2mRNA和蛋白表達(dá)水平呈明顯的升高。 結(jié)論：EphA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒能夠成功有效地在SRA01/04細(xì)胞中表達(dá)。 第三部分：EphA2基因過表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移的影響 目的：觀察EphA2基因過表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移的影響。 方法：SRA01/04細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)并分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和EphA2表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞；用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移情況。 結(jié)果：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EphA2轉(zhuǎn)染的SRA01/04細(xì)胞增殖比空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SRA01/04細(xì)胞明顯加快（P=0.0003）。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，EphA2轉(zhuǎn)染的SRA01/04細(xì)胞比空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SRA01/04細(xì)胞進(jìn)入S期比例明顯增多（P=0.008，t=㧟4.988）；而兩種細(xì)胞凋亡比例無明顯差異(P=0.486，t=0.776)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EphA2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞遷移速度比空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯加快（P＜0.001）。 結(jié)論：EphA2基因過表達(dá)能夠促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞增殖和遷移、加快細(xì)胞周期的進(jìn)程，而對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響。 第四部分：EphA2基因過表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 目的：觀察EphA2基因過表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 方法：SRA01/04細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)并分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和EphA2表達(dá)質(zhì)粒，48小時(shí)后獲得過表達(dá)EphA2的SRA01/04細(xì)胞，然后分別用200μM H2O2處理24小時(shí)；CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例和ROS含量；Western blot檢測(cè)BCL-2、BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：EphA2基因過表達(dá)可提高SRA01/04細(xì)胞存活率，降低H2O2誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡比例和ROS含量，并可增加BCL-2蛋白表達(dá)，及抑制BAX蛋白表達(dá)，但對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)水平無明顯影響。 結(jié)論： EphA2基因過表達(dá)能夠保護(hù)H2O2對(duì)SRA01/04細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能是通過增加BCL-2蛋白表達(dá)及抑制BAX蛋白表達(dá)。 第五部分：EphA2基因表達(dá)水平與大鼠白內(nèi)障發(fā)生的相關(guān)研究 目的：觀察EphA2基因在大鼠白內(nèi)障晶狀體中表達(dá)水平的變化情況。 方法：選取36只SD大鼠的晶狀體，分為3組，每組12只，分別是2月齡透明晶狀體組（青年組）、16-18月齡透明晶狀體組（老年組）和16-18月齡白內(nèi)障晶狀體組（白內(nèi)障組）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)青年組、老年組和白內(nèi)障組晶狀體中的EphA2表達(dá)水平。 結(jié)果：Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示EphA2蛋白在白內(nèi)障組中表達(dá)水平明顯低于老年組（P=0.0000006，t=10.952）；而老年組比青年組EphA2蛋白表達(dá)水平呈明顯的升高（P=0.001，t=㧟4.456）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，白內(nèi)障組EphA2mRNA表達(dá)水平較老年組明顯的升高（P=0.001，t=㧟4.518）；而老年組EphA2mRNA較青年組EphA2mRNA表達(dá)水平呈明顯下降（P=0.000009，t=8.237）。 結(jié)論： EphA2蛋白表達(dá)水平下降與大鼠白內(nèi)障發(fā)生密切相關(guān)。隨著大鼠月齡的增加，EphA2蛋白表達(dá)水平呈輕度升高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R776.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2424252