【摘要】：目的本研究的目的在于全面深化了解氧誘導(dǎo)C57小鼠造模過程中視網(wǎng)膜血管的形態(tài)學(xué)變化,為準(zhǔn)確、充分利用這一模型進(jìn)行視網(wǎng)膜新生血管疾病研究提供直觀、詳實(shí)的動物模型資料；系統(tǒng)分析C57小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育、分化、增殖以及氧濃度變化情況下視網(wǎng)膜基因表達(dá)的變化,篩選視網(wǎng)膜新生血管性疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素,并應(yīng)用基因干擾技術(shù)初步探討篩選基因Edn2的作用。 方法針對C57野生型小鼠及氧誘導(dǎo)小鼠,應(yīng)用FD-2000S進(jìn)行血管內(nèi)灌注,取小鼠視網(wǎng)膜按時間點(diǎn)連續(xù)鋪片,觀察C57小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育、分化情況及氧誘導(dǎo)過程中視網(wǎng)膜血管的變化,并進(jìn)行評分；根據(jù)視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果,選擇不同時間點(diǎn),分別為高氧初期、高氧晚期、相對低氧(即常氧)早期、血管增生與發(fā)育期、血管發(fā)育與成熟期5個實(shí)驗(yàn)組,提取高氧誘導(dǎo)及野生型小鼠視網(wǎng)膜RNA,利用小鼠全基因組表達(dá)譜芯片進(jìn)行核苷酸雜交,應(yīng)用SAM軟件篩選差異表達(dá)基因,David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋,對部分篩選結(jié)果應(yīng)用Real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建篩選的差異基因Edn2的干擾RNA,建立高糖體外模型,通過劃痕試驗(yàn)、Western Blot、Real-time PCR、Elisa等方法對Edn2的功能進(jìn)行初步探討。 結(jié)果視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示,C57野生型小鼠出生時無視網(wǎng)膜血管,隨日齡增加視網(wǎng)膜血管從視盤發(fā)出呈放射狀生長,至第7-9天淺層血管長滿視網(wǎng)膜。小鼠出生9天左右視網(wǎng)膜血管由淺層向深層分化,約至第16天時三層血管網(wǎng)分化基本完成,直至成年視網(wǎng)膜血管網(wǎng)無明顯改變。C57氧誘導(dǎo)小鼠置于高氧環(huán)境后,視網(wǎng)膜后極部及中周部迅速出現(xiàn)大范圍無灌注區(qū)并持續(xù)存在。小鼠進(jìn)入常氧環(huán)境后,周邊視網(wǎng)膜血管開始向中央及深層生長,在小鼠出氧箱后5-6天時新生血管增生最明顯,在生后21-23天時視網(wǎng)膜三層血管網(wǎng)布滿視網(wǎng)膜。基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示高氧初期表達(dá)異�；蛞韵抡{(diào)為主,主要參與代謝、血管形態(tài)發(fā)生和發(fā)育、細(xì)胞增殖過程；高氧晚期表達(dá)異�；蛞韵抡{(diào)為主,主要參與細(xì)胞粘附、對刺激(如光及有機(jī)、無機(jī)物)的反應(yīng)、視覺感知和凋亡過程；相對低氧初期表達(dá)異常基因以上調(diào)為主,主要參與氧化還原、代謝和能量、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、體內(nèi)平衡、血管增生和收縮、視細(xì)胞分化和發(fā)育、低氧反應(yīng)等過程。有6個主要基因Acta2, Edn2, Hmoxl, Vegfa, Gpil, Anxa2參與了血管增生和收縮過程；血管增生與血管發(fā)育視網(wǎng)膜比較,表達(dá)異�；蛞陨险{(diào)為主,主要參與神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)程、感覺、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞粘附和增殖、血管的進(jìn)程；發(fā)育期與成熟期視網(wǎng)膜相比較,表達(dá)異常基因以下調(diào)基因?yàn)橹?主要參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)、自穩(wěn)態(tài)過程、視覺感知、神經(jīng)元的形成和分化、細(xì)胞粘附、增殖和定位、細(xì)胞凋亡、對刺激的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管增生過程。Edn2干擾實(shí)驗(yàn)顯示Edn2與細(xì)胞的遷移性相關(guān),并可能對Vegf, Timp2, Vtn等因子有上調(diào)作用。 結(jié)論C57小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型是成熟的視網(wǎng)膜新生血管動物模型,同時也是研究氧變化對組織、血管影響的良好動物模型；基因譜表達(dá)分析提供了大量與疾病密切相關(guān)但即往未知的生物學(xué)信息,有利于全面掌握病變的進(jìn)程和機(jī)制,開拓研究思路；Edn2在視網(wǎng)膜新生血管性疾病中可能起著重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱潔,王雨生,惠延年;細(xì)胞外基質(zhì)與脈絡(luò)膜新生血管[J];中華眼底病雜志;2005年01期

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本文編號：2401590