【摘要】：第一章：兩個(gè)Waardenburg綜合征Ⅳ型家系的臨床特征及相關(guān)基因突變研究 目的：收集了兩個(gè)Waardenburg綜合征Ⅳ型家系(WSO1家系和WS02家系),擬對(duì)其進(jìn)行臨床診斷分析和基因突變檢測研究。 方法：對(duì)兩個(gè)家系成員進(jìn)行了病史采集、臨床聽力學(xué)分析及體格檢查,并進(jìn)行了Waardenburg綜合征Ⅳ型相關(guān)基因(EDNRB.EDN3.SOX10基因)的外顯子測序以篩查致病突變。 結(jié)果：WS01家系一共兩代5人,先證者與其大姐分別為Waardenburg綜合征Ⅳ型和Waardenburg綜合征Ⅱ型患者,兩位患者均表現(xiàn)為左眼虹膜異色,先證者伴有先天性巨結(jié)腸；WS02家系先證者為1歲女童,Waardenburg綜合征Ⅳ型患者,雙側(cè)虹膜異色,伴有先天性巨結(jié)腸。三位患者聽力學(xué)檢查均提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾,眼底檢查呈現(xiàn)晚霞狀改變,無皮膚毛發(fā)顏色異常及內(nèi)眥移位。WSOl家系的先證者及其大姐均檢測到有SOX10基因的2號(hào)外顯子上存在c.254GA (P. Trp85X)雜合突變,而先證者的母親(正常人)SOX10基因的2號(hào)外顯子上也檢測到有c.254GA雜合突變,多次測序后發(fā)現(xiàn)突變峰的高度僅為正常峰高度的1/3；WS02家系的先證者SOX10基因的4號(hào)外顯子測序發(fā)現(xiàn)一個(gè)剪接位點(diǎn)的雜合突變c.698-2AT,患者的父母未攜帶此突變。用直接測序法對(duì)100例不相關(guān)的正常人進(jìn)行SOX10基因突變c.254GA和c.698-2AT的檢測,結(jié)果沒有檢測到相同突變。 結(jié)論：1.本研究所報(bào)道的Waardenburg綜合征Ⅳ型病例屬國內(nèi)首次報(bào)道；2.SOX10基因突變位點(diǎn)c.254GA(P. Trp85X)和c.698-2AT屬于新發(fā)突變位點(diǎn),目前國內(nèi)外尚無此突變位點(diǎn)的報(bào)道；3.SOX10基因可能存在鑲嵌體。 第二章：一個(gè)常染色體顯性遺傳性耳聾大家系的致病位點(diǎn)定位研究 目的：為明確一來自湖南張家界地區(qū)非綜合征型常染色體顯性遺傳耳聾家系的基因診斷,對(duì)此家系進(jìn)行了初步的定位及候選基因篩查工作 方法：收集了一4代人的常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾家系,家系中一共有41人,由于家系發(fā)病年齡在20-30歲左右,故將未到達(dá)發(fā)病年齡的家系成員排除在研究外。本研究共對(duì)家系中14名成員(其中包括7名患者和7名正常人)進(jìn)行了臨床診斷分析、遺傳基因定位及基因篩查研究。首先,根據(jù)家系耳聾患者的臨床表型及遺傳方式,對(duì)家系成員進(jìn)行了最常見的非綜合征型顯性耳聾基因COCH、EYA4、GJB2、GJB3基因的直接測序排查及與家系表型相似的耳聾致病位點(diǎn)的排除定位分析。排除分析后應(yīng)用Illumina linkage芯片對(duì)該家系進(jìn)行了全基因組掃描以初步定位致病區(qū)間,在初步定位的區(qū)間內(nèi)挑選MARKER進(jìn)行精細(xì)定位。最后,對(duì)精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的已知耳聾基因進(jìn)行直接測序篩查家系致病突變。 結(jié)果：家系臨床特征表現(xiàn)為：語后聾,20-30歲左右發(fā)病,發(fā)病初期表現(xiàn)為耳鳴及高頻聽力下降,40歲左右進(jìn)行性發(fā)展為雙耳重至極重度聾。排除COCH、EYA4、GJB2、GJB3基因及相關(guān)耳聾致病位點(diǎn)后進(jìn)行了全基因組掃描及微衛(wèi)星精細(xì)定位,經(jīng)過多點(diǎn)Lod值的計(jì)算及單體型分析最終將該家系的致病區(qū)間定位在chr1:P34.2-P34.3 (D1S2656;D1S3721)約8.21cM的區(qū)間,在D1S2729和D1S2892marker得到了最大多點(diǎn)lod值3.1,此區(qū)間與已定位的DFNA2位點(diǎn)重疊,對(duì)DFNA2位點(diǎn)上兩個(gè)己克隆耳聾基因GJB3和KCNQ4進(jìn)行直接測序篩查后未發(fā)現(xiàn)與家系相關(guān)的致病突變。 結(jié)論：DFNA2位點(diǎn)上可能存在其他的基因參與該家系耳聾的發(fā)生。 第三章：Illumina Goldengate 384k高通量耳聾基因篩查芯片的設(shè)計(jì)、研發(fā)及其對(duì)遺傳性耳聾家系的檢測 目的：設(shè)計(jì)、制備Illumina Goldengate 384K高通量耳聾基因篩查芯片,采用此芯片以期在更廣的范圍內(nèi)對(duì)已知耳聾突變位點(diǎn)進(jìn)行篩查和對(duì)耳聾大家系進(jìn)行己定位耳聾位點(diǎn)的排除定位。 方法：芯片設(shè)計(jì)原則：由于芯片的引物探針需間隔60bp以上才能確保準(zhǔn)確的雜交,故我們在找出所有己知耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上,首先挑選出目前文獻(xiàn)報(bào)道有2篇以上的突變位點(diǎn),再依據(jù)60bp距離盡可能多的將剩余的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在芯片上,一共選取了240個(gè)耳聾相關(guān)突變位點(diǎn),包括77個(gè)顯性突變位點(diǎn)及163個(gè)隱性突變位點(diǎn)。另外,我們在亞洲人群中報(bào)道的己克隆耳聾相關(guān)基因中,選取了144個(gè)SNP位點(diǎn),整張芯片共384個(gè)檢測點(diǎn)。該芯片可進(jìn)行已知耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)的高通量篩查和耳聾相關(guān)家系的初步排除定位。我們通過對(duì)465例DNA樣本進(jìn)行Illumina GoldenGate 384K高通量耳聾基因芯片篩查,統(tǒng)計(jì)芯片Call rate、對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證、對(duì)芯片中144個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析及對(duì)芯片的排除定位連鎖分析進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)90個(gè)耳聾家系的135例DNA樣本的芯片檢測結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果：1.芯片總的Call rate為96.32%,Call rate達(dá)到100%的位點(diǎn)有110個(gè)；2.對(duì)芯片上的GJB2_235delC突變檢測點(diǎn)進(jìn)行了準(zhǔn)確性驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)芯片此檢測點(diǎn)的假陽性率為3/97(3.1%),假陰性率為0；3.芯片中有8個(gè)基因的19個(gè)SNP位點(diǎn)的最小等位基因頻率小于0.1(10%)；4.芯片對(duì)本研究中一耳聾家系的定位位置與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描定位的位置相同,認(rèn)為該芯片能較準(zhǔn)確的進(jìn)行耳聾相關(guān)基因的排除定位連鎖分析；5.在此次患者樣本檢測中共有12個(gè)基因的31個(gè)突變檢測位點(diǎn)在耳聾家系患者中有檢出,剩余有189個(gè)檢測位點(diǎn)在此次檢測中無檢出。這189個(gè)耳聾突變位點(diǎn)在中國耳聾家系人群中則可能屬于罕見的突變位點(diǎn)。對(duì)90個(gè)耳聾家系的135例DNA樣本的芯片檢測結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)GJB2_235delC、SLC26A4_IVS7-2AG等突變位點(diǎn)與目前國內(nèi)報(bào)道的突變檢出率相似,PJVK_988delG (57.36%)、SLC26A4_Gly497Ser (7.14%)等既往報(bào)道中的非熱點(diǎn)突變在此次耳聾家系患者中也具有很高的突變檢出率。結(jié)論：研究所設(shè)計(jì)的高通量耳聾基因篩查芯片可以更廣范圍內(nèi)對(duì) 一些不常檢測的耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測及可對(duì)耳聾家系進(jìn)行初步排除定位。PJVK_988delG (57.36%)、SLC26A4_Gly497Ser (7.14%)等既往報(bào)道中的非熱點(diǎn)突變在耳聾家系患者中具有很高的突變檢出率,其是否是多肽或是與檢測人群不同有關(guān)還是芯片檢測的準(zhǔn)確性問題?我們將在下一步工作中對(duì)有檢出的突變位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證,并對(duì)芯片設(shè)計(jì)內(nèi)容進(jìn)行調(diào)整,剔除突變頻率較低、Call rate及準(zhǔn)確性低的耳聾相關(guān)突變位點(diǎn),加入由于突變位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)要求60bp間距而在此次設(shè)計(jì)中未加入芯片的耳聾相關(guān)突變位點(diǎn),剔除最小等位基因頻率10%的SNP位點(diǎn),并選擇同一位置的其他SNP位點(diǎn)進(jìn)行替換,進(jìn)一步完善芯片。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R764

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2398514