【摘要】：血管紋內(nèi)體液-血液屏障(the intrastrial fluid-blood barrier)是血迷路屏障(blood-lybrinth barrier, BLB)的主要構(gòu)成,它將內(nèi)淋巴和血液分隔開。血迷路屏障從廣義上講,應(yīng)該包括血-內(nèi)淋巴、血-外淋巴、內(nèi)-外淋巴之間的屏障。在本文中重點(diǎn)研究的是血管紋內(nèi)淋巴-血液間的屏障,簡稱血迷路屏障。該屏障對于維持內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),尤其是耳蝸內(nèi)電位的形成非常重要,這些也正是形成正常聽力的基礎(chǔ)。很多聽力相關(guān)性疾病,如自身免疫性內(nèi)耳病,噪音相關(guān)性耳聾,老年性聾等都與該屏障功能障礙有關(guān)。然而對血迷路屏障的調(diào)節(jié)和機(jī)制研究很少。過去研究認(rèn)為,血迷路屏障由基質(zhì)膜和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。內(nèi)皮細(xì)胞被緊密連接結(jié)合在一起,從而形成了阻礙大部分血源性物質(zhì)進(jìn)入內(nèi)耳的一道屏障。我們近期的研究發(fā)現(xiàn),該屏障還有大量的周細(xì)胞和血管周常駐巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞(perivascular resident macrophage, PVM/Ms)。PVM/Ms借助胞漿足突與血管緊密連接,也正是與血管的這種特殊結(jié)構(gòu),預(yù)示了這類細(xì)胞的特殊功能。構(gòu)成血-迷路屏障的各類細(xì)胞功能和形態(tài)復(fù)雜,PVM/Ms尤其如此,所以非常值得探討。我們的早期試驗(yàn)中證實(shí),PVM/Ms具有巨噬細(xì)胞的表面抗原,如F4/80,CD68, CDllb,所以將其界定為組織常駐巨噬細(xì)胞。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞還具有黑色素細(xì)胞表面抗原和中間細(xì)胞的表面抗原。上述事實(shí)證明,PVM/Ms不同于傳統(tǒng)意義上的組織常駐巨噬細(xì)胞,在內(nèi)耳中,它還兼具多種細(xì)胞特性。因?yàn)檫@種細(xì)胞在形態(tài)上與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類似,我們推測,他們是否具有像血腦屏障和血視網(wǎng)膜屏障中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的類似作用呢?眾所周知,星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)屏障系統(tǒng)通透性上有著重要作用。如果沒有這些細(xì)胞,緊密連接相關(guān)蛋白缺失,致使內(nèi)皮細(xì)胞間通透性增加,引起組織水腫。在本實(shí)驗(yàn)中,我們將通過探討血管紋中內(nèi)皮細(xì)胞(endothial cells, ECs)和PVM/Ms之間的關(guān)系及調(diào)控微血管通透性的機(jī)制來說明PVM/Ms對于血迷路屏障的重要性。這里分別通過體內(nèi)試驗(yàn)和體外模型來研究。首先,通過掃描電鏡分析和免疫熒光染色后3D重建,分析PVM/Ms在血管紋中的分布特點(diǎn)；利用RT-PCR等方法檢測其可能具有的特性；接著自小鼠耳蝸血管紋內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng),原代培養(yǎng)并建立ECs和PVM/Ms細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)；后續(xù)使用攜帶DT受體的轉(zhuǎn)基因小鼠,消除PVM/Ms后進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；最后我們利用轉(zhuǎn)染技術(shù)等調(diào)控基因的表達(dá),證明了色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor, PEDF)可能是PVM/Ms調(diào)控血迷路屏障的信號分子機(jī)制。結(jié)果表明,PVM/Ms具有黑色素顆粒,通過胞體足突與血管紋內(nèi)的血管網(wǎng)緊密連接,其表面表達(dá)F4-80、GST、GSTA4、 Kir4.1等特征性抗原；并且PVM/Ms通過調(diào)控PEDF的表達(dá),調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而使血迷路屏障通透性改變。這證明了PVM/Ms作為一種多元化細(xì)胞,同時(shí)具備巨噬細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及中間細(xì)胞的特性,它通過PEDF介導(dǎo)等信號分子機(jī)制,影響血管紋中血迷路屏障的通透性,因而對維持聽力非常重要。第一部分：小鼠內(nèi)耳外周常駐巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞的特點(diǎn)和在血迷路屏障中的分布目的：分析PVM/Ms在血管紋中的分布特點(diǎn)及可能具有的細(xì)胞特性,為下一步的功能研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。方法：1.掃描電鏡觀察血管紋的超微結(jié)構(gòu)。2.免疫熒光化學(xué)染色法檢測PVM/Ms具有的表面抗原。3.分別原代培養(yǎng)PVM/Ms和自小鼠血管紋中提取PVM/Ms。4. RT-PCR方法檢測PVM/Ms具有的基因特性。結(jié)果：1.電鏡及免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示,PVM/Ms中具有黑色素顆粒,通過胞體足突與血管紋內(nèi)的血管網(wǎng)緊密連接,其表面表達(dá)F4-80、GST、GSTA4、Kir4.1等特征性抗原。2.免疫熒光化學(xué)染色及RT-PCR結(jié)果表明PVM/Ms中可見F4-80、GST、GSTA4、 Kir4.1 mRNA的表達(dá)。結(jié)論：1.本文通過免疫熒光染色法和RT-PCR等方法分析檢測了PVM/Ms的特征,結(jié)果顯示PVM/Ms是兼具血管紋內(nèi)中間細(xì)胞、組織常駐巨噬細(xì)胞和黑色素細(xì)胞特性的多功能細(xì)胞。2.通過給予PVM/Ms免疫化學(xué)染色后,對血管紋進(jìn)行電鏡掃描及3D結(jié)構(gòu)重建,進(jìn)一步分析PVM/Ms在血管紋中的分布特點(diǎn)。結(jié)果證明PVM/Ms存在于血管紋中,在結(jié)構(gòu)上伸出足板與毛細(xì)血管壁緊緊相連,可能對調(diào)節(jié)血迷路屏障發(fā)揮重要作用。第二部分：內(nèi)耳外周常駐巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞調(diào)節(jié)血迷路屏障通透性的機(jī)制研究目的：通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)的研究,探討內(nèi)耳外周常駐巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞調(diào)節(jié)血迷路屏障的機(jī)制。方法：1.建立ECs和PVM/Ms原代細(xì)胞系,利用共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬建立血迷路屏障。2.半透膜方法檢測模擬血迷路屏障在PVM/Ms存在前后的滲透性。3.利用轉(zhuǎn)基因小鼠,建立PVM/Ms消除的動(dòng)物模型,并進(jìn)行聽功能測試。4.用不同方法檢測PVM/Ms消除的小鼠血管紋內(nèi)毛細(xì)血管的通透性。5.利用模擬血迷路屏障,從基因及蛋白的角度分析PVM/Ms對內(nèi)皮細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)ZO-1、Occludin、Ve-cadherin等的調(diào)控。6.通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述觀點(diǎn)。結(jié)果：1.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果示PVM/Ms缺失后內(nèi)皮單細(xì)胞層通透性增加。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示消除PVM/Ms可以引起小鼠血管顯著滲出和聽力障礙。3. PVM/Ms通過調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控屏障系統(tǒng)的通透性。結(jié)論：1.本文自小鼠血管紋組織建立起ECs和PVM/Ms原代細(xì)胞系,可用于后續(xù)研究,且利用共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬血迷路屏障,為進(jìn)一步的功能研究提供了基礎(chǔ)。2.本研究分別通過體外實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn),借助不同的分子生物學(xué)手段反復(fù)論證了PVM/Ms對于調(diào)節(jié)血迷路屏障及維持正常聽力的重要性。第三部分：血管旁常駐巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞通過調(diào)控PEDF表達(dá)調(diào)節(jié)血迷路屏障的通透性目的：通過給予PEDFsiRNA,分別從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管旁常駐巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞通過調(diào)控PEDF表達(dá)調(diào)節(jié)血迷路屏障的通透性。方法：1.通過免疫熒光化學(xué)染色法和ELISA法確定PVM/Ms和ECs可分別表達(dá)PEDF及PEDFRo2.分別轉(zhuǎn)染原代PVM/Ms和活體小鼠,并確定轉(zhuǎn)染效率。3.利用模擬血迷路屏障系統(tǒng),從基因及蛋白的角度分析,在轉(zhuǎn)染前后PVM/Ms對內(nèi)皮細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)ZO-1、Occludin、Ve-cadherin等的調(diào)控。4.通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述觀點(diǎn)。結(jié)果：1.免疫熒光化學(xué)染色法和ELISA法確定PVM/Ms和ECs可分別表達(dá)PEDF及PEDFR。2.免疫熒光及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果證明體內(nèi)及體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PEDF基因表達(dá)抑制引起細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白質(zhì)基因及蛋白水平表達(dá)下降。4.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PEDF基因表達(dá)抑制引起細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白質(zhì)基因及蛋白水平表達(dá)下降。結(jié)論：1.血迷路屏障通透性改變是由于內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白質(zhì)ZO-1, occludin和ve-cadherin等的表達(dá)降低引起的,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均可以證實(shí)PEDF可以調(diào)控以上三種蛋白的表達(dá)。2.我們的實(shí)驗(yàn)還看到PVM/Ms和ECs分別表達(dá)PEDF和PEDFR,說明PVM/Ms調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的機(jī)制之一可能是PEDF和PEDFR介導(dǎo)的信號途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2396901