【摘要】： 視網(wǎng)膜新生血管性眼底病是一類常見的致盲性疾病,如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等均可因新生血管增生、牽拉而導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生原因至今仍不是十分清楚,是眼科關(guān)注的重點(diǎn)問題之一。視網(wǎng)膜缺血、缺氧是形成視網(wǎng)膜新生血管的重要原因,缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管的生成是常用的復(fù)制視網(wǎng)膜新生血管性疾病,特別是研究早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的常用方法[1,2]。但是缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成與所采用的動(dòng)物品系有關(guān)。另外有文獻(xiàn)報(bào)道[3],視網(wǎng)膜色素變性患者及視網(wǎng)膜退行性變模式小鼠很少生成視網(wǎng)膜新生血管,為新生血管疾病的治療帶來了新的希望。早期的工作中,我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一種快速視網(wǎng)膜變性小鼠(Retinal degeneration fast,rdf)及兩種自發(fā)性基因突變模式大鼠,分別為先天性靜止性夜盲(congenital stationary night-blindness,CSNB)大鼠[4]和視網(wǎng)膜錐細(xì)胞失功能(retinal conedystfunction,RCD)大鼠[5],其在成年時(shí)僅主要表現(xiàn)為功能性的改變,而視網(wǎng)膜光感受器則無明顯的退行性變化。為進(jìn)一步探索視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生機(jī)制,我們參照文獻(xiàn)方法[6],對(duì)新生的模式動(dòng)物采用高濃度氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管制備模型,觀察三種模式動(dòng)物的視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生特點(diǎn)。 材料和方法 選擇清潔級(jí)、鼠齡為7d的SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠、rdf×C57BL/6J小鼠、rdf×C57BL/6J雜合子小鼠及rdf小鼠各1窩,每窩(即每組) 6只為高氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)組,正常對(duì)照組為以上6種品系同齡新生鼠各1窩每窩(即每組) 6只。(正常SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買,突變品系動(dòng)物由第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)。將實(shí)驗(yàn)組新生鼠與母鼠共同置于密閉的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)氧艙(DWC450-1150型,上海七0一所楊園醫(yī)用氧艙廠)。氧艙內(nèi)接入濕化醫(yī)用純氧,氧氣的流量控制在0.5-0.75L /min,使氧艙內(nèi)氧濃度保持在80%±2%,氧艙內(nèi)氣壓保持為常壓。用數(shù)字測(cè)氧儀(Ceramatec公司生產(chǎn)的Maxo2 Oxygen Analyzer,ModelOM225AE)測(cè)量艙內(nèi)的氧濃度,氧濃度穩(wěn)定后每間隔2h監(jiān)測(cè)1次,使其始終保持在80%±2%。每天打開氧艙更換墊料、加水、添食1次。在此環(huán)境中飼養(yǎng)5d,然后回到正常氧環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)5d至第17d。正常對(duì)照組新生鼠與母鼠飼養(yǎng)于正常氧環(huán)境至第17d。 按Browning等[7]報(bào)道的墨汁灌注顯色法,各組新生鼠在P18時(shí)進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片,即在鐘形罩下乙醚吸入深度麻醉,心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛各10ml后,灌注墨汁與明膠水溶液(1:50)混合液,比例為1:2,每只新生鼠灌注3ml,而后迅速取出雙側(cè)眼球,固定于4%多聚甲醛中24h,將其中1只眼球在解剖顯微鏡下去除角膜、晶狀體、玻璃體和鞏膜。完整剝離視網(wǎng)膜組織,以視乳頭為中心做4個(gè)放射狀切開,將視網(wǎng)膜平鋪于掛膠載玻片上,50%甘油封片后在光鏡下觀察視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生情況。 取另1只眼放入4%多聚甲醛溶液中4℃固定24h后,去除前節(jié),制作成眼杯。酒精常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋,切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位連續(xù)4μm切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)。每只眼球取20張切片,相鄰兩張間隔30μm,用雙盲法計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù),統(tǒng)計(jì)每只眼球每張切片突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。選取切片時(shí)應(yīng)避開視乳頭周圍,僅計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜有聯(lián)系的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)[9]。 各組新生小鼠按以上大鼠做視網(wǎng)膜組織切片的方法一眼做視網(wǎng)膜組織切片,另一眼用免疫組織化學(xué)方法,以v-WF因子染色識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞。(所用一抗、二抗由美國(guó)sigma公司提供。)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中見棕黃色為陽(yáng)性。 結(jié)果 在正常飼養(yǎng)環(huán)境下,RCD大鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)稀疏,SD大鼠視網(wǎng)膜切片偶見內(nèi)皮細(xì)胞。在高氧/復(fù)氧誘導(dǎo)下,各實(shí)驗(yàn)組新生鼠視網(wǎng)膜血管正常放射狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞,結(jié)構(gòu)稀疏,血管迂曲、收縮或擴(kuò)張,部分血管出現(xiàn)閉塞,可見無灌注區(qū)。其中SD大鼠、CSNB大鼠視網(wǎng)膜有出血點(diǎn),甚至片狀出血。組織切片顯示除對(duì)照組的SD大鼠中偶見突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核外,其他5組均未見。實(shí)驗(yàn)組中SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠、rdf×C57BL/6J小鼠、rdf×C57BL/6J雜合子小鼠和rdf小鼠6種品系中均可見較多的突破內(nèi)界膜內(nèi)皮細(xì)胞核,計(jì)數(shù)結(jié)果分別為24.10±2.49 , 38.20±10.47 ,68.00±3.06,16.95±5.12,25.52±6.90,29.15±23.79,與同品系的對(duì)照組有顯著性的差異(P0.01);與不同品系的實(shí)驗(yàn)組比較也均有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論 1、采用高氧/復(fù)氧可以成功誘導(dǎo)出大鼠視網(wǎng)膜新生血管。 2、氧誘導(dǎo)的新生大鼠視網(wǎng)膜新生血管與品系有關(guān),視網(wǎng)膜退行性變大鼠仍可誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜新生血管,且嚴(yán)重程度可能與感光細(xì)胞的功能有關(guān)。 3、rdf在高氧/復(fù)氧誘導(dǎo)下有視網(wǎng)膜新生血管,與rd1有明顯的不同。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2388432