【摘要】：目的鼻咽癌(NPC)是嚴(yán)重威脅人民群眾健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,目前治療鼻咽癌最有效的手段是以放療為主并結(jié)合化療的綜合治療,但這兩種方式的副作用都較大,嚴(yán)重影響了治療的進(jìn)行。因此尋找新的抗腫瘤藥物就成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)苦參堿在抑制腫瘤生長(zhǎng)、殺傷和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面表現(xiàn)出顯著活性,并受到廣泛關(guān)注。但由于苦參堿抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的有效劑量較高,并不是一個(gè)高效治療腫瘤的藥物。因此,本課題組為了提高其抗癌效力,以苦參堿為先導(dǎo)化合物,通過(guò)化學(xué)合成方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,合成了20個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的苦參堿衍生物,并進(jìn)行了抗鼻咽癌作用的篩選。從中初步篩出具有抗腫瘤活性成分——14-噻吩基次亞甲基苦參堿體(下文稱(chēng)改構(gòu)體X),本實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn)改構(gòu)體X具有強(qiáng)于苦參堿的體外抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖的作用。為了進(jìn)一步研究其抗腫瘤的作用和機(jī)制,本課題將系統(tǒng)地研究14-噻吩基次亞甲基苦參堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE1、 CNE2體內(nèi)外的抗鼻咽癌作用,以其能找出確切有效的抗鼻咽癌的藥物并為下一步獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)治療鼻咽癌的新藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容： 第一部分14-噻吩基次亞甲基苦參堿體外抗鼻咽癌作用的實(shí)驗(yàn)研究 方法分別以14-噻吩基次亞甲基苦參堿和苦參堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1, CNE2進(jìn)行干預(yù),利用MTT法檢測(cè)改構(gòu)體X對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,電鏡下觀察改構(gòu)體X對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期,Western blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)等情況。 結(jié)果經(jīng)MTT法發(fā)現(xiàn)在體外兩種藥物對(duì)CNE1及CNE2細(xì)胞均有抑制作用,其抑制作用呈劑量依賴(lài)性,且苦參堿經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造后的化合物14-噻吩基次亞甲基苦參堿顯示出強(qiáng)于其先導(dǎo)化合物苦參堿的抑制作用,其1-5天的IC50值分別低于對(duì)應(yīng)天數(shù)的苦參堿的IC50。 形態(tài)學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),14-噻吩基次亞甲基苦參堿作用鼻咽癌細(xì)胞后,光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞變圓變小；改構(gòu)體X作用48h后電鏡下觀察可見(jiàn)兩種鼻咽癌細(xì)胞均呈凋亡的形態(tài)改變,如細(xì)胞皺縮,核內(nèi)異染色質(zhì)明顯增多,核周隙增大,凋亡小體形成等形態(tài)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比14-噻吩基次亞甲基苦參堿各劑量組、苦參堿IC50劑量組以及順鉑組對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞株均有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,其P0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。14-噻吩基次亞甲基苦參堿對(duì)CNE1的促凋亡作用從數(shù)據(jù)上顯示強(qiáng)于對(duì)CNE2細(xì)胞的促凋亡作用。 細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示：對(duì)于細(xì)胞系CNE1,14-噻吩基次亞甲基苦參堿各劑量組和苦參堿處理組均可將CNE1細(xì)胞阻滯于G1期,隨改構(gòu)體X濃度的增加,其阻滯作用逐漸增強(qiáng),其G1期的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組G1期細(xì)胞(P0.01)。順鉑則可使CNE1細(xì)胞阻滯于S期；對(duì)于細(xì)胞系CNE2,與對(duì)照組相比,可以看到改構(gòu)體X各劑量組S期細(xì)胞比例均有所升高,其中,高劑量組差異具有顯著性意義(P0.05),苦參堿處理組和順鉑組則可將CNE2細(xì)胞阻滯于G1期并有顯著差異(P0.01)。 Western blot結(jié)果顯示：藥物作用CNE1細(xì)胞48h后,14-噻吩基次亞甲基苦參堿各劑量組細(xì)胞內(nèi)Bax、p53蛋白含量隨劑量的增大而升高,三種劑量處理下與陰性組相比均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01),并有一定的劑量依賴(lài)性,Caspase-3,-8和-9的含量也有不同程度升高,其中,中、高劑量組與陰性對(duì)照組相比具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)；苦參堿處理后Bax明顯高于對(duì)照組(P0.05),p53蛋白則未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Caspase-3、8、9的含量與對(duì)照組相比也顯著增高(P0.05)；順鉑組Bax、p53、Caspase-3,-8的含量與陰性對(duì)照組相比顯著增高,均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,P0.01)；苦參堿、改構(gòu)體X高劑量組以及順鉑組細(xì)胞Bcl-2含量顯著低于對(duì)照組(P0.05,P0.01)。 對(duì)于CNE2細(xì)胞,藥物作用48h后,14-噻吩基次亞甲基苦參堿中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Bax和Caspase-9與陰性對(duì)照組相比顯著升高(P0.05,P0.01),改構(gòu)體X各劑量組Caspase-3蛋白均有不同程度的升高,且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.05,P0.01),抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)則顯著降低(P0.05,P0.01)；苦參堿處理后Bax和Caspase-9表達(dá)有所增高,但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Caspase-3的含量與對(duì)照組相比顯著增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并能顯著下調(diào)Bcl-2的表達(dá)；順鉑組各蛋白表達(dá)情況與苦參堿類(lèi)似。 第二部分14-噻吩基次亞甲基苦參堿體內(nèi)抗鼻咽癌的研究 方法將CNE1及CNE2細(xì)胞分別接種于裸鼠腋下建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,待腫瘤長(zhǎng)至一定體積后設(shè)14-噻吩基次亞甲基苦參堿組、苦參堿、順鉑組及對(duì)照組進(jìn)行治療,每日測(cè)量裸鼠的體重、瘤體體積等,治療15天后取出瘤體并測(cè)量瘤重。另結(jié)合光鏡下觀察瘤組織HE染色、透射電鏡下觀察瘤組織超微結(jié)構(gòu)變化、原位組織化學(xué)法(TUNEL法)檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)Bcl-2, Bax、 p53、Caspase-3和-9的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：隨著14-噻吩基次亞甲基苦參堿給藥劑量的增加可以發(fā)現(xiàn)瘤體積增長(zhǎng)幅度越來(lái)越小、瘤重越來(lái)越輕。光鏡下觀察HE染色切片可見(jiàn)各給藥組瘤細(xì)胞比例減少,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腫瘤細(xì)胞被大量成纖維細(xì)胞包裹,電鏡下可見(jiàn)給藥組細(xì)胞細(xì)胞核核仁濃縮或碎裂,并見(jiàn)到類(lèi)圓形的凋亡小體；在原位組織化學(xué)法(Tunnel法)檢測(cè)中可見(jiàn)藥物組凋亡細(xì)胞所占比例增加；在免疫組織化學(xué)法中可見(jiàn)給藥后細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白出現(xiàn)表達(dá)下調(diào),Bax、p53、Caspase-3和-9蛋白的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：14-噻吩基次亞甲基苦參堿在體內(nèi)外均具有抑制人鼻咽癌CNE1和CNE2細(xì)胞增殖的作用。且產(chǎn)生抑制作用的劑量都低于其先導(dǎo)化合物苦參堿。其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯,上調(diào)促凋亡蛋白Bax、p53、Caspase-3、-8和-9等的表達(dá),下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān),并可能與Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2384032