【摘要】：第一部分 Sox10而非MMP-24調(diào)節(jié)小鼠胚胎時期內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)的遷移研究目的：哺乳動物聽覺系統(tǒng)的發(fā)育受到內(nèi)在基因和外在環(huán)境共同影響,是造成新生兒先天性耳聾的重要因素。內(nèi)耳不同結(jié)構(gòu)來自不同的干細(xì)胞它們分別遷移分化發(fā)育,然后連接成為有機(jī)的整體,發(fā)揮信息傳遞功能。與大部分來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞的外周感覺神經(jīng)元不同,耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞同耳感覺上皮等耳蝸結(jié)構(gòu)起源于耳基板,其外周包繞的施萬細(xì)胞則是神經(jīng)嵴細(xì)胞分化而來。在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中,螺旋神經(jīng)節(jié)前體細(xì)胞經(jīng)歷了從耳基板穿過基底膜最終到達(dá)Resenthal's小管的遷移過程,然后發(fā)出神經(jīng)纖維支配柯蒂氏器的內(nèi)外毛細(xì)胞目前我們對于耳蝸螺旋神經(jīng)的發(fā)生發(fā)育過程中的確切基因及分子機(jī)制仍知之甚少。已證實Sox10基因?qū)ι窠?jīng)嵴細(xì)胞的分化發(fā)育起關(guān)鍵作用,缺失可導(dǎo)致神經(jīng)性耳聾等聯(lián)合癥狀為特征的瓦登伯格綜合征(WS, Waardenburg Syndrome)。文獻(xiàn)顯示,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對于細(xì)胞外基質(zhì)(ECMs)的蛋白水解重構(gòu),腫瘤的轉(zhuǎn)移,胚胎發(fā)育,神經(jīng)再生有重要作用,其中MMP-24被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞中,其是否在內(nèi)耳神經(jīng)元遷移過程中參與基底膜的降解,以及是否受到Sox10基因缺失影響從而引起內(nèi)耳發(fā)育異常尚未有相關(guān)研究報道。 實驗方法：獲得MMP-24-/-和Wntl-cre; Sox10f/f基因敲除小鼠,對小鼠進(jìn)行多聚甲醛心臟灌注并解剖。制作MMP-24和Sox10RNA探針并進(jìn)行全組織原位雜交。環(huán)氧樹脂包埋,切片。親脂性熒光染料示蹤外周和中樞神經(jīng)走行。 實驗結(jié)果：nRNA原位雜交技術(shù)顯示MMP-24大量表達(dá)于胚胎早期在內(nèi)耳遷移的神經(jīng)元中。隨后用MMP-24標(biāo)記神經(jīng)元,用Sox10標(biāo)記神經(jīng)嵴分化細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在Wntl-cre; Sox10基因敲除小鼠中神經(jīng)嵴細(xì)胞來源的外周感覺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少而耳基板來源的耳蝸前庭神經(jīng)元未見減少。同時,我們發(fā)現(xiàn)Sox10的表達(dá)缺失雖不能顯著影響螺旋神經(jīng)節(jié)的存活,但可以導(dǎo)致其過度遷移至異常位置。進(jìn)一步應(yīng)用親脂性神經(jīng)染料示蹤技術(shù)標(biāo)記螺旋神經(jīng)節(jié)的傳出神經(jīng)和后腦耳蝸核的中樞支配,發(fā)現(xiàn)在生后一天MMP-24基因敲除小鼠中,螺旋神經(jīng)節(jié)的外周和中樞神經(jīng)纖維與正常組無異。 研究結(jié)論：以上結(jié)果說明雖然MMP-24可以標(biāo)記胚胎早期遷移的螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元,但其對于胚胎早期螺旋神經(jīng)元的遷移和神經(jīng)纖維和發(fā)育都不是必須的,可能有其他功能相似的基因與MMP-24協(xié)同產(chǎn)生作用。Sox10基因敲除可能導(dǎo)致包繞螺旋神經(jīng)的施萬細(xì)胞缺失,從而引起神經(jīng)元的遷移異常。 第二部分 Wnt1-cre性敲除Sox10基因?qū)е滦∈髢?nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)遷移和支配異常 研究目的：耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞同耳感覺上皮等耳蝸其他結(jié)構(gòu)起源于耳基板,其外周包繞的施萬細(xì)胞則是神經(jīng)嵴細(xì)胞分化而來。研究發(fā)現(xiàn),ErbB2基因敲除導(dǎo)致小鼠內(nèi)耳施萬細(xì)胞缺失后其螺旋神經(jīng)節(jié)遷移位置異常,發(fā)出的神經(jīng)纖維雜亂稀疏,但仍能支配外周和中樞相應(yīng)區(qū)域。由于ErbB2在內(nèi)耳不僅表達(dá)于施萬細(xì)胞還表達(dá)于支持細(xì)胞,因此并不能明確區(qū)分是哪種細(xì)胞對神經(jīng)元神經(jīng)纖維提供了導(dǎo)向作用。在前期實驗中我們用神經(jīng)嵴細(xì)胞特異性的Wntl-cre條件性敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox10,以期消除神經(jīng)嵴細(xì)胞源性細(xì)胞內(nèi)Sox10基因的表達(dá),而不影響基板源性細(xì)胞內(nèi)Sox10的表達(dá)。建立了一種新的模型可用來評估僅僅施萬細(xì)胞缺失對于內(nèi)耳神經(jīng)支配的影響。 實驗方法：獲得Wntl-cre; Sox10f/f基因敲除小鼠并檢測基因型。對小鼠進(jìn)行多聚甲醛心臟灌注并解剖耳蝸。使用P75NTR和NT-3RNA探針進(jìn)行全耳蝸原位雜交。環(huán)氧樹脂包埋,切片,Stevenel's Blue染色。用不同抗體進(jìn)行免疫組織熒光化學(xué)檢測：MyoVII抗體標(biāo)記毛細(xì)胞,Neurofilament標(biāo)記傳出神經(jīng),Tubulin標(biāo)記傳入神經(jīng),Caspase3和PSVue標(biāo)記凋亡細(xì)胞,Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核。親脂性熒光染料示蹤外周和中樞神經(jīng)纖維走行。 實驗結(jié)果：Sox10基因敲除導(dǎo)致內(nèi)耳施萬細(xì)胞缺失,引起螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞遷移越過Rosenthal小管到達(dá)蝸軸,甚至有些神經(jīng)元沿蝸軸遷移出內(nèi)耳,到達(dá)內(nèi)耳門位置。我們測量了5對E18.5的小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞到耳蝸內(nèi)側(cè)壁的距離(圖2)。發(fā)現(xiàn)在耳蝸中段螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞到耳蝸內(nèi)側(cè)壁的距離,Sox10基因突變組(Mean=125μm; St.Dev=28; N=5)是正常組(Mean=34μm; St.Dev=14; N=5)的4倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA, P0.05)。可見施萬細(xì)胞的缺失導(dǎo)致螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯的過度遷移。在Sox10基因敲除小鼠內(nèi)耳中,螺旋神經(jīng)元可以發(fā)出纖維到達(dá)毛細(xì)胞支配Corti器,但是還有許多傳入神經(jīng)越過Corti器到達(dá)耳蝸的外側(cè)壁。值得注意的是,由螺旋神經(jīng)元發(fā)出至中樞耳蝸核的神經(jīng)纖維與正常并無差別。與ErbB2基因敲除小鼠內(nèi)耳相比,條件性基因敲除Sox10螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元的凋亡數(shù)量有限,且神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3表達(dá)正常。說明單施萬細(xì)胞的缺失對于胚胎時期神經(jīng)元的發(fā)生和存活作用不大。 研究結(jié)論：以上數(shù)據(jù)表明,神經(jīng)嵴細(xì)胞來源的施萬細(xì)胞對于內(nèi)耳聽覺神經(jīng)元的中樞分布和部分外周的神經(jīng)纖維不是必需的。施萬細(xì)胞的缺失不能直接引起螺旋神經(jīng)節(jié)的凋亡,但施萬細(xì)胞為遷移的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提供終止信號,同時引導(dǎo)傳入神經(jīng)延伸并準(zhǔn)確定位于Corti器。Sox10可能通過ErbB2調(diào)節(jié)施萬細(xì)胞的分化和存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.3

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2383772