發(fā)布時(shí)間：2018-12-14 01:26

【摘要】：一、研究背景 鼻咽癌是我國南方諸省及東南亞發(fā)病率高,危害大的惡性腫瘤之一。遺傳因素及包括EB病毒(Ebstein Barr病毒)在內(nèi)的環(huán)境因素可能是鼻咽癌發(fā)病中最具危險(xiǎn)性的因素。鼻咽癌治療以放療為主,輔以化療等方法。近年來雖然放療及化療在設(shè)備和技術(shù)上取得了很大的進(jìn)步,但鼻咽癌的5年生存率仍維持在50%左右。此外,放化療帶來的全身及局部副作用給病人的身心造成了極大的傷害,并未從根本上改善治療效果。因此,探索鼻咽癌的病因及新的安全有效的治療方法成為鼻咽癌治療的瓶頸。 包括鼻咽癌在內(nèi)的絕大多數(shù)惡性腫瘤與端粒酶活性及其亞單位hTERT (human telomerase reverse transcriptase)活性增高有密切關(guān)系。以端粒酶為靶點(diǎn)的腫瘤靶向基因治療成為有希望的治療方法之一,因而,探尋端粒酶抑制劑成為新的熱點(diǎn)研究之一。近年來,一個(gè)潛在的端粒酶抑制劑-PinX1 (Pin2/TRF1 interacting protein 1)基因被發(fā)現(xiàn)。它存在于正常人體組織中,而在腫瘤組織中則相應(yīng)的低表達(dá)或不表達(dá)。PinX1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞端粒酶／端粒的調(diào)控作用機(jī)制比較復(fù)雜。一些研究發(fā)現(xiàn),PinX1基因能夠抑制胃癌及肝癌細(xì)胞中的端粒酶活性從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另一些研究提示,在白血病中,PinX1基因與端粒酶活性存在正相關(guān)。還有一些在前列腺癌、胃腸道癌及髓母細(xì)胞瘤的研究中認(rèn)為,PinX1并非抑制端粒酶的關(guān)鍵因素,可能是基因的多態(tài)性現(xiàn)象。最新研究表明,PinX1作為微管結(jié)合蛋白對穩(wěn)定染色體有重要作用�？傊�,PinX1基因在不同腫瘤中的作用機(jī)制可能不同。 目前PinX1基因是否對鼻咽癌有抑制端粒酶活性及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用尚未見報(bào)道,我們以此為切入點(diǎn),結(jié)合已有的研究基礎(chǔ),成功構(gòu)建PinX1基因表達(dá)載體pEGFP-C3-PinXl及針對PinX1基因的小干擾RNA(PinX1-FAM-siRNA),并進(jìn)行了深入研究,將其轉(zhuǎn)染有高轉(zhuǎn)移高成瘤潛能的人鼻咽癌細(xì)胞5-8F,觀察PinX1的mRNA表達(dá)變化,對細(xì)胞體外增殖、遷移及愈合能力的影響,對端粒酶活性及細(xì)胞周期和凋亡的影響,為探討PinX1基因的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制,為鼻咽癌的基因治療提供理論依據(jù)。 二、研究目的 構(gòu)建PinX1基因表達(dá)載體pEGFP-C3-PinX1及針對PinX1基因的小干擾RNA(PinX1-FAM-siRNA),將其轉(zhuǎn)染有高轉(zhuǎn)移高成瘤潛能的人鼻咽癌細(xì)胞5-8F,觀察PinX1的mRNA表達(dá)變化,對細(xì)胞體外增殖、遷移及愈合能力的影響,對端粒酶活性及細(xì)胞周期和凋亡的影響,探討PinX1基因調(diào)控端粒酶活性表達(dá)對人鼻咽癌細(xì)胞5-8F凋亡的作用和意義。 三、實(shí)驗(yàn)方法 1.細(xì)胞株 人鼻咽癌細(xì)胞5-8F及人臍靜脈細(xì)胞ECV-304均由南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。 2.細(xì)胞培養(yǎng) 將人鼻咽癌5-8F細(xì)胞株在RPMI 1640培養(yǎng)液以及人臍靜脈細(xì)胞ECV-304在DMEM培養(yǎng)液(含10%新生牛血清,青霉素100U/ml,鏈霉素100U/ml)中,37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),常規(guī)消化傳代,選取處于指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。 3.質(zhì)粒構(gòu)建及提取 pEGFP-C3-PinX1、pEGFP-C3表達(dá)質(zhì)粒由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司構(gòu)建,能編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP,在E.coli及真核細(xì)胞中表現(xiàn)卡那霉素抗性。該載體大小為4700bp,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選卡那霉素抗性克隆,雙向測序鑒定重組質(zhì)粒。大量搖菌擴(kuò)增后,抽提質(zhì)粒純化。 4. siRNA體外化學(xué)合成 針對PinX1基因序列,采用Invitrogen公司在線軟件(http://maidesigner.Invitrogen.com/,maiexpress/)設(shè)計(jì)候選的siRNA序列,同時(shí)進(jìn)行人類基因組BLAST搜索及同源性分析,最后挑選3個(gè)候選序列作為實(shí)驗(yàn)之用,分別為PinX1-963、PinX1-695、PinX1-242,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PinX1-695為有效siRNA,該序列sense:5'-GUAAAGAUGUGGAAAGUUATT-3', antisense: 5'-TTCAUUUCUACACCUUUCAAU-3'. 5.實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)分五組：A組：pEGFP-C3-PinX1組(轉(zhuǎn)染帶PinX1基因的質(zhì)粒)；B組：pEGFP-C3組(轉(zhuǎn)染不帶PinX1基因的空質(zhì)粒)；C組：脂質(zhì)體組(只加脂質(zhì)體)；D組：空白細(xì)胞組(常規(guī)培養(yǎng)的5-8F細(xì)胞,不加任何干擾因素)；E組：PinX1-FAM-siRNA組(轉(zhuǎn)染針對PinX1基因的小干擾RNA)。細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,用不含抗生素的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24h后(細(xì)胞密度約為80%-90%),用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-PinX1、pEGFP-C3質(zhì)粒和PinX1-FAM-siRNA, C組單加脂質(zhì)體,具體操作參照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24-48h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。 6. RT-PCR測定PinX1 mRNA的表達(dá)水平 用Trizol提取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞總RNA,采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, PinX1上游引物為5'-TTTT CTCGAG ATG TCT ATG CTG GCT GAA CG-3',下游引物為5'-TTTT GAATTC TCA TTT GGA ATC TTT CTT C-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度為987bp。GAPDH作為內(nèi)參照,上游引物為5'GGAAGATGGTGATGGGATT3'下游引物為5'GGATTTGGTCGTATTGGG 3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度為205bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min,94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,共25個(gè)循環(huán),最后72℃再延伸5min。電泳后UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像, Quantity one軟件分析條帶灰度值,用PinX1/GAPDH代表PinX1 mRNA的相對表達(dá)量。 7.MTT檢測細(xì)胞增殖能力 MTT法分析不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力(0h、24h、48h、72h),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別檢測6個(gè)復(fù)孔。測量各組的OD490nm值,繪制生長曲線,并計(jì)算各組的生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(IR)=(對照組OD490—干擾組OD490)/對照組OD490×100%。 8. RT-PCR測定hTERTmRNA的表達(dá)水平 用Trizol提取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞總RNA,采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。hTERT上游引物為5'-CCGAGTGACCGTGGTTTCTGTG-3',下游引物為5'-GGAAGCGGCGTTCGTTGTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度為670bp。GAPDH作為內(nèi)參照,上游引物為5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3',下游引物為5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度為205bp。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,49℃退火30s,72℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃再延伸5min。電泳后UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Quantity one軟件分析條帶灰度值,用hTERT/GAPDH代表hTERT mRNA的相對表達(dá)量。 9. Stretch PCR法檢測細(xì)胞端粒酶活性 采用日本東洋紡生物科技有限公司的TeloChaser試劑盒,將對數(shù)生長期的5-8F細(xì)胞(1×106/孔)接種到六孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后,分別將質(zhì)粒pEGFP-C3-PinX1, pEGFP-C3,脂質(zhì)體以及PinX1-FAM-siRNA轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞,48h后采用Stretch PCR法檢測細(xì)胞端粒酶活性,比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞端粒酶活性的改變,同時(shí)檢測對照細(xì)胞ECV-304的端粒酶活性。具體方法參照試劑盒說明書操作。 10. Transwell小室趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。消化,PBS洗滌,離心,棄上清,將細(xì)胞重懸于RPMI1640中,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,用按200μL/上室加入細(xì)胞懸液,下室每室加5001μL含10%新生牛血清(作為趨化因子)的RPMI-1640培養(yǎng)液。37℃5%C02培養(yǎng)24h后,取出上室,用棉簽擦去膜上室面的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定膜下室面的細(xì)胞15min,1×PBS清洗3次,每次5min,結(jié)晶紫染色3min,1×PBS清洗干凈,吹風(fēng)機(jī)干燥膜。細(xì)胞遷移性結(jié)果表示為穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),顯微鏡下每個(gè)復(fù)孔上、下、左、右、中隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)(400x)。 11.劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞,細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞呈單層貼壁生長狀態(tài)。用100μL的tip頭在各組單細(xì)胞層上劃痕,用含10% FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0h、12h、24h、36h每個(gè)孔取4個(gè)視野拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前兩側(cè)細(xì)胞層距離-愈合后兩側(cè)細(xì)胞層距離)/愈合前兩側(cè)細(xì)胞層距離]×100%。 12.流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期和凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞(1×106/樣品),PBS洗滌細(xì)胞。用PBS重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml, Annexin V/PI(碘化丙錠溶液)染色,避光15min,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況,凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù))×100%；另外用冰預(yù)冷的75%乙醇4℃固定經(jīng)PBS洗滌的細(xì)胞樣品后測細(xì)胞周期。 13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,半定量RT-PCR、端粒酶活性檢測、細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期凋亡實(shí)驗(yàn)的顯著性檢驗(yàn)采用One-Way ANOVA方差分析,方差齊性的多重比較采用LSD法,方差不齊的多重比較用Dunnett's T3法。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)采用兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析,多重比較用SNK法。同一時(shí)間點(diǎn)不同組間的比較和同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較One-Way ANOVA方差分析。參數(shù)比較均先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若方差不齊,用基于方差不齊的近似F檢驗(yàn)Welch法。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 成功構(gòu)建PinX表達(dá)載體pEGFP-C3-PinXl,雙向測序鑒定證實(shí)序列完全正確。 2.細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察 各組均見有綠色熒光細(xì)胞,約占細(xì)胞總數(shù)的80%。 3. RT-PCR檢測細(xì)胞PinX1 mRNA的表達(dá)量 5組鼻咽癌細(xì)胞5-8F,前4組均能擴(kuò)增出987bp的PinX1基因片段,條帶強(qiáng)弱不一致。與D組相比,A組轉(zhuǎn)染帶PinX1基因的質(zhì)粒后,PinX1 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),表明質(zhì)粒能有效的上調(diào)PinX1基因的表達(dá)；E組轉(zhuǎn)染針對PinX1基因的小干擾RNA后,PinX1 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)了70%,有效地沉默了PinX1基因的表達(dá),B、C、D組之間PinX1 mRNA的表達(dá)無顯著性差異(P0.05),提示處理過程中空白質(zhì)粒pEGFP-C3和脂質(zhì)體對細(xì)胞PinX1 mRNA的表達(dá)無影響。 4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.870,P=0.000),不同組間的活細(xì)胞數(shù)不同。不同時(shí)間點(diǎn)的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=437.621,P=0.000),活細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長而顯著增多。時(shí)間與組別間存在交互效應(yīng)(F=4.592,P=0.000),說明五組間的差異隨時(shí)間變化而變化。逐一分析個(gè)因素的單獨(dú)效應(yīng),A組的OD490值(X=2.15)顯著低于D組和E組(X=2.52,X=2.50),表明pEGFP-C3-PinX1對5-8F細(xì)胞增殖呈顯著的抑制作用,而PinX1-FAM-siRNA對5-8F細(xì)胞增殖無顯著影響。以細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h)的OD490值繪制細(xì)胞生長曲線,并計(jì)算出的生長抑制率 5.細(xì)胞遷移能力的檢測 結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.162,P=0.000),表明不同的處理對5-8F細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力影響不同。pEGFP-C3-PinX1上調(diào)PinX1表達(dá)后,5-8F細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)性降低(與空白細(xì)胞組相比,P=0.000)。其它pEGFP-C3,脂質(zhì)體、PinX1-FAM-siRNA三種處理對細(xì)胞趨化活動(dòng)性無顯著作用(與空白細(xì)胞組相比,均有P0.05)。 6.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞愈合能力 采用兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=182.366,P=0.000),pEGFP-C3-PinX1組的劃痕愈合率(X=31%)顯著低于空白細(xì)胞組(X=50%),提示PEGFP-C3-PinXl組上調(diào)PinX1的表達(dá)能抑制細(xì)胞的愈合能力；而PinX1-FAM-siRNA組與空白細(xì)胞組的劃痕愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.083),表明siRNA沉默上調(diào)PinX1基因的表達(dá)對細(xì)胞的愈合能力無顯著影響。 7. hTERT mRNA的表達(dá)水平和端粒酶活性檢測結(jié)果 結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-PinX1上調(diào)PinX1表達(dá)后,5-8F細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)降低(降低了29.9%),端粒酶活性降低(與正常5-8F相比,P=0.000)。其它pEGFP-C3、脂質(zhì)體、PinX1-FAM-siRNA三種處理對細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)和端粒酶活性無顯著作用(均有P0.05)。 8.細(xì)胞周期和凋亡情況 (1)細(xì)胞周期單因素方差分析細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù),pEGFP-C3-PinXl處理的5-8F細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增加(與空白細(xì)胞組相比,P=0.000),細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。其它各種處理對5-8F細(xì)胞的GO/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無顯著影響(P0.05)。 (2)凋亡分析AnnexinⅤ(-)/PI(-)為活細(xì)胞(左下象限),AnnexinⅤ(+)/PI(-)為早期凋亡細(xì)胞(右下象限),AnnexinⅤ(-)/PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞(右上象限),凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)=早期凋亡指數(shù)+晚期凋亡指數(shù)。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.489,P=0.000)。pEGFP-C3-PinXl組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡指數(shù)較空白對照細(xì)胞組顯著升高(與空白細(xì)胞組比較,P=0.006),提示PinX1基因能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,轉(zhuǎn)染48h凋亡指數(shù)達(dá)(49.73±2.70%)。pEGFP-C3組、脂質(zhì)體組、PinX1-FAM-siRNA組與空白細(xì)胞組細(xì)胞凋亡指數(shù)無顯著性差異(P0.05),提示這三種處理對細(xì)胞凋亡無顯著影響。 五、結(jié)論 轉(zhuǎn)染外源PinX1基因可顯著下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中端粒酶活性及其hTERT mRNA表達(dá),抑制該腫瘤細(xì)胞增殖和遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而沉默PinX1基因的表達(dá)可以抵消PinX1基因的上述作用,即對細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA的表達(dá)以及細(xì)胞增殖遷移、細(xì)胞凋亡的作用。表明PinX1基因是一個(gè)潛在的端粒酶活性抑制劑,可能通過靶向調(diào)控端粒酶途徑來抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖發(fā)展,本研究將為鼻咽癌的靶向基因治療開辟新領(lǐng)域。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 牟少鳳;文忠;郭夢和;謝民強(qiáng);關(guān)小芳;申聰香;;hTERT啟動(dòng)子調(diào)控TK基因靶向性殺傷鼻咽癌移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2009年02期

2 文忠,郭夢和,肖健云,田勇泉,趙素萍,唐發(fā)清;維甲酸抑制鼻咽癌端粒酶和hTR表達(dá)及誘導(dǎo)凋亡的研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2002年10期

3 申聰香;文忠;錢宇虹;牟少鳳;關(guān)小芳;;鼻咽癌細(xì)胞中增強(qiáng)型表達(dá)載體調(diào)控TK基因與端粒酶活性關(guān)系的研究[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2010年04期

4 孫潔;譚亞敏;黃河;朱園園;藍(lán)建平;來曉瑜;;白血病細(xì)胞中端粒酶抑制因子Pinx1的表達(dá)與端粒酶活性關(guān)系的研究[J];中國病理生理雜志;2006年09期

5 田勇泉,文忠,肖健云,趙素萍,唐發(fā)清;hTR反義寡核苷酸誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的研究[J];中國耳鼻咽喉顱底外科雜志;1999年04期

6 賀楚峰;趙素萍;肖健云;王承龍;唐瑤云;徐婧;蔡鑫章;;小干擾RNA抑制鼻咽癌細(xì)胞hTERT基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國耳鼻咽喉顱底外科雜志;2006年02期

7 文忠,肖健云,唐發(fā)清,田勇泉,趙素萍;鼻咽癌病人端粒酶表達(dá)的研究[J];中國耳鼻咽喉顱底外科雜志;1998年04期

8 文忠,肖健云,唐發(fā)清,田勇泉,趙素萍,諶兵來;Expression of telomerase and its RNA in nasopharyngeal carcinoma[J];Chinese Medical Journal;2000年06期

9 王行煒,肖健云,趙素萍,田勇泉,王光平;鼻咽癌端粒酶各組分基因表達(dá)與端粒酶活性的關(guān)系[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2001年09期

10 曹前;駱文龍;吳家廉;;HTR反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細(xì)胞生長及對其致瘤能力的影響[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年08期

，

本文編號：2377639