發(fā)布時間：2018-11-28 20:09

【摘要】： 【研究背景】 視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞層位于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞與Bruch膜及脈絡(luò)膜之間,支持著視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞,是維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分。人RPE (human RPE,hRPE)細(xì)胞損傷性疾病,如年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration,AMD)、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferation vitreoretinopathy,PVR)以及視網(wǎng)膜色素變性等,是造成視力喪失的重要原因。RPE層一旦損傷,由病變區(qū)周圍健康的RPE細(xì)胞向損傷區(qū)移行增生,以修復(fù)損傷區(qū),這一過程對結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)十分重要。 在細(xì)胞修復(fù)的過程中,有多種復(fù)雜的因素參與,其中伴有電場的作用。外加電場可以明顯促進(jìn)皮膚和角膜上皮損傷的修復(fù)。我們研究組前期的研究結(jié)果表明,在較短的時間內(nèi),電場能夠引導(dǎo)hRPE細(xì)胞向負(fù)極移動,而且低于10 V/cm的電場強度對hRPE細(xì)胞的正�；钚约胺至压δ軣o明顯不良影響。但是,單有外加電場的作用,似乎不足以促進(jìn)hRPE細(xì)胞較快地移行修復(fù)缺損區(qū)。因此,我們試圖尋找能夠加快細(xì)胞在電場中移行的因子。 有許多分子與細(xì)胞的移行有關(guān)。而人類甲酰肽受體(Formyl Peptide Receptor,FPR,1976年發(fā)現(xiàn))是一種化學(xué)趨化受體,是介導(dǎo)細(xì)胞在一系列細(xì)胞因子的作用下移行的G蛋白偶聯(lián)受體,與激動劑結(jié)合可以使PI3K,NF-κB和MAPK等激活,調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化和移行。 根據(jù)我們前期電場實驗的結(jié)果,以及對FPR的文獻(xiàn)回顧,推測可以將兩者結(jié)合共同引入到促進(jìn)RPE細(xì)胞移行修復(fù)的過程中,為RPE損傷性疾病的治療提供一個新的治療途徑。 【目的】 1.確定FPR在hRPE細(xì)胞的表達(dá)及定位;觀察激活FPR,電場引導(dǎo)hRPE細(xì)胞層的移行修復(fù),以及在此過程中細(xì)胞間連接mRNA的表達(dá)和其超微結(jié)構(gòu)的變化,細(xì)胞骨架的變化。 2.研究此移行修復(fù)過程中PI3K/Akt信號通路的變化,Rho GTP ases家族蛋白的表達(dá)。 3.研究此移行修復(fù)過程中細(xì)胞因子,如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、白介素(interleukin 8,IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1 )的表達(dá)和分泌。 【方法】 1.將hRPE細(xì)胞培養(yǎng)于含有fMLF(FPR經(jīng)典激動劑)的培養(yǎng)液中,應(yīng)用RT-PCR方法確定hRPE細(xì)胞表達(dá)FPR,免疫熒光染色方法著染FPR,從而進(jìn)一步確定FPR在細(xì)胞上的表達(dá)與定位。根據(jù)本研究的前期實驗結(jié)果,直接將細(xì)胞置于6 V/cm電場下,應(yīng)用免疫熒光三標(biāo)染色法著染FPR、F-actin以及胞核,通過激光共聚焦顯微鏡觀察電場作用的hRPE細(xì)胞骨架F-actin和FPR的變化及定位關(guān)系。免疫熒光三標(biāo)染色法著染細(xì)胞骨架F-actin、Vimentin及胞核,觀察激活FPR促進(jìn)電場引導(dǎo)hRPE細(xì)胞層的損傷修復(fù)以及電場引導(dǎo)下細(xì)胞骨架F-actin和Vimentin的變化。顯微鏡照相系統(tǒng)連續(xù)記錄每1 h細(xì)胞移行的距離和細(xì)胞損傷范圍的變化。并通過RT-PCR檢測細(xì)胞間連接mRNA的表達(dá),透射電子顯微鏡來觀察細(xì)胞間連接的超微結(jié)構(gòu)改變。 2.初步研究激活FPR受體通過PI3K / Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA,促進(jìn)電場引導(dǎo)下hRPE細(xì)胞層移行修復(fù)。應(yīng)用RT-PCR檢測Cdc42、Rac和RhoA mRNA的變化,應(yīng)用Western blotting檢測PI3K / Akt,以及RhoA GTPases家族中Cdc42、Rac1和RhoA蛋白表達(dá)的變化。 3.觀察激活FPR在電場作用下,采用RT-PCR和ELISA方法檢測EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表達(dá)和分泌,以及加入FPR拮抗劑,PI3K/Akt阻斷劑和Rho GTP ases阻斷劑后因子的表達(dá)和分泌變化。 【結(jié)果】 1.首次確定了hRPE細(xì)胞表面存在FPR。應(yīng)用FPR經(jīng)典激動劑fMLF激活hRPE細(xì)胞的FPR,通過RT-PCR檢測到hRPE細(xì)胞的FPR mRNA表達(dá)。同時揭示FPR與F-actin之間存在共定位關(guān)系。在電場作用下,hRPE細(xì)胞向陰極方向伸出偽足,朝向陰極的方向移行,FPR與F-actin在細(xì)胞的偽足上共定位,而在拮抗劑Boc和激動劑fMLF作用下,hRPE細(xì)胞的FPR表達(dá)減少。在電場和FPR的作用下,可以明顯促進(jìn)hRPE細(xì)胞層的移行和損傷修復(fù)。將hRPE細(xì)胞培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)液組,20%血清培養(yǎng)液組及fMLF培養(yǎng)液組,電場作用3 h后,hRPE細(xì)胞層的移行距離分別為24.262±6.82μm,40.243±5.069μm(1.7倍),和56.926±7.821μm(2.4倍)。在無血清培養(yǎng)液組,20%血清培養(yǎng)液組和fMLF培養(yǎng)液組中可檢測出CX-43和ZO-1 mRNA的表達(dá),而E-cadherin mRNA的表達(dá)卻分別在2 h,30 min和1 h時檢測到。透射電鏡可以觀察到細(xì)胞間連接的的超微結(jié)構(gòu):包括緊密連接,縫隙連接,橋粒樣結(jié)構(gòu)和粘著斑。電場下細(xì)胞骨架的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,細(xì)胞偽足朝向陰極方向,并表達(dá)F-actin,其熒光亮度在1 h時,達(dá)到峰值106.49±8.21,隨后逐漸下降。 2.在電場作用下,Western blotting結(jié)果顯示pAkt在hRPE細(xì)胞中的表達(dá),均在30 min時達(dá)到最高,無血清培養(yǎng)液組為0.6±0.012,20%血清培養(yǎng)液組1.36±0.093,含fMLF培養(yǎng)液組為2.44±0.089。加入FPR拮抗劑Boc后,發(fā)現(xiàn)pAkt蛋白的表達(dá)量明顯降低。通過RT-PCR檢測到Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA mRNA的表達(dá)在激活FPR受體后在30 min時明顯增加,Western blotting的結(jié)果提示其蛋白表達(dá)量在電場作用1 h時明顯增加,在含fMLF培養(yǎng)液組增加明顯,分別為3.5±0.2,5.5±0.21,4.78±0.22,加入PI3K/Akt通路阻斷劑LY294002后,Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA的表達(dá)明顯降低。 3.在電場作用下,RT-PCR結(jié)果顯示EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1 mRNA表達(dá)在1 h時達(dá)到高峰,而ELISA結(jié)果提示培養(yǎng)液上清中四種因子的分泌量在2 h時,達(dá)到高峰,含fMLF培養(yǎng)液組四種因子的表達(dá)量和分泌量較其他組升高明顯。加入FPR拮抗劑Boc,PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑LY294002以及Rho GTP ases阻斷劑Y27632,發(fā)現(xiàn)EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表達(dá)量和分泌量下降。 【結(jié)論】 1.首次確定hRPE細(xì)胞表達(dá)FPR,并與細(xì)胞骨架F-actin共定位表達(dá)。激活FPR,在電場作用下,hRPE細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和極性的改變,朝向陰極伸出偽足,向陰極移行,在細(xì)胞偽足上可見FPR與F-actin共定位,說明FPR的激活與hRPE細(xì)胞的移行修復(fù)有關(guān)。激活hRPE細(xì)胞FPR,顯著促進(jìn)了RPE細(xì)胞層在電場作用下的移行,并能引起細(xì)胞骨架蛋白F-actin的改變。細(xì)胞間連接mRNA的表達(dá)及其超微結(jié)構(gòu)的觀察,說明hRPE細(xì)胞層的損傷修復(fù)是成層移行的。 2.激活hRPE細(xì)胞FPR,在電場作用下,通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,活化Cdc42、Rac1和RhoA蛋白,說明FPR的作用至少是通過PI3K/Akt的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。 3.激活hRPE細(xì)胞FPR,在電場作用下,誘導(dǎo)EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表達(dá)和分泌,而且與FPR激活、PI3K/Akt激活、Rho GTP ases活化相關(guān)。 以上研究國內(nèi)外未見相關(guān)報道。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2364122