【摘要】：研究背景和目的： 鼻咽癌好發(fā)于中國南方,特別是廣東省,發(fā)病率最高因此又被稱為“廣東瘤”,是一種具有地域性和家族聚集性的高度惡性腫瘤。鼻咽癌的發(fā)生是一個多階段、多途徑、多機制的過程。流行病學(xué)調(diào)查顯示,鼻咽癌的發(fā)生涉及到遺傳傾向性和環(huán)境致癌因素,很可能是遺傳易感性個體,接受了致癌物的作用而發(fā)生的。其中包括各種環(huán)境因素、EBV感染和遺傳及表遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致瘤基因過表達及抑瘤基因表達下調(diào)或缺失,經(jīng)過癌前病變,最終發(fā)生鼻咽癌。 腫瘤的生成涉及多種基因和基因以外的變化,任何單獨一種基因的改變不足以致瘤,多種基因變化的積累才能引起控制細胞生長和分化的機制紊亂,使細胞的生長失控而瘤變。在這些基因的變化中,最常發(fā)生兩類基因的異常變化,即瘤基因及腫瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同樣涉及多基因的表達改變。在過去幾十年中,雖然我們對于鼻咽癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)認識已經(jīng)有了很大的提高,但這些認識還是遠遠不能完全揭示鼻咽癌的發(fā)病機理。因此,鼻咽癌相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)和研究仍將有助于進一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機理。 Enolasel基因的表達隨細胞病理生理、代謝、發(fā)育狀況的不同而改變,其主要編碼兩種蛋白。多數(shù)情況下,a-enolase(即ENO1)是烯醇化酶家族中3種同功酶之一,是一個高度保守的胞漿糖酵解酶,既可催化糖酵解過程中2-磷酸-D-甘油酸(PGA)向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP)的轉(zhuǎn)化,又可在糖原合成過程中,催化逆向反應(yīng),即作為磷酸丙酮酸水合酶,使PEP向PGA轉(zhuǎn)化,在細胞能量代謝過程中起重要的作用。另一種稱為c—myc啟動子結(jié)合蛋白(MBP—1),不具有酶活性,可表達于細胞核,與核DNA c—myc啟動子結(jié)合,負向調(diào)控c—myc的表達。c-myc基因是一種細胞核內(nèi)癌基因,它編碼的核內(nèi)轉(zhuǎn)化蛋白p62對正常細胞生長和分化起重要調(diào)節(jié)作用。c-myc表達活性與細胞生長分裂關(guān)系密切,據(jù)認為它是誘導(dǎo)增殖和凋亡雙重作用的基因。正常情況下C-myc基因不顯示轉(zhuǎn)錄活性或低水平表達。c-myc基因被激活后可致其產(chǎn)物p62過度表達而堆積在細胞內(nèi),使細胞獲得永生。近年來多項研究表明c-myc基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,其在腫瘤組織中的表達率與患者的生存期呈顯著相關(guān)。這也提示ENO1除了作為糖酵解反應(yīng)的限速酶外,還參與細胞的其他生物學(xué)活動。 在早期對ENO1研究中發(fā)現(xiàn),ENO1能夠抑制腫瘤細胞的生長。但有趣的是,與前述ENO1抑制腫瘤細胞增生的作用截然不同,近年來越來越多的研究表明,ENO1在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中所發(fā)揮的作用并非如早年研究所指出的,是一個具有潛在抑癌能力的基因。與之相反,近年來的研究結(jié)果不斷表明,ENO1很可能是一個在腫瘤生發(fā)發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)過程中均發(fā)揮作用的重要癌基因。目前提出ENO1可能具有癌基因功能的多項研究主要集中在肝癌、非小細胞肺癌、甲狀腺嗜酸細胞瘤以及黑色素細胞瘤等腫瘤上。通過蛋白質(zhì)組學(xué),western blot和免疫組化等技術(shù)發(fā)現(xiàn),ENO1在這些腫瘤的細胞系、活體組織中有較高水平表達。并且,多篇文獻指出,在多種腫瘤患者的外周血中,檢測出的ENO1自身抗體的水平與該類腫瘤的分化、分期及預(yù)后顯示出明顯的正相關(guān)關(guān)系。在對ENO1促進腫瘤細胞生長機制的探討中,大多數(shù)認為ENO1在腫瘤細胞生長過程中的能量代謝過程中起到積極作用,尤其是大多數(shù)腫瘤在高代謝情況下,其生長對于糖酵解作用獲能的依賴成為目前研究的重點。在增殖較快的腫瘤細胞中,ENO1有相對高水平的表達；而在非增殖的角質(zhì)化細胞中,ENO1的合成明顯減少。由于糖酵解過程的變化與細胞增殖有關(guān),故推測,在腫瘤細胞增殖過程中,ENO1的表達可以通過影響糖酵解,三羧酸循環(huán),以及隨后的氧化磷酸化酶作用物的水平,進而影響ATP的合成,這對腫瘤細胞的生長十分重要。 但目前有關(guān)ENO1在鼻咽癌中的作用的研究還未見報道。在本研究所方唯意等研究中,利用基因芯片技術(shù)對8組NPC病人標本及對照,兩組細胞株進行了基因篩選,結(jié)果顯示,在病理標本及細胞株中,ENO1的表達均顯著提高。因此,本課題旨在研究ENO1在鼻咽癌細胞及組織中的表達特性,并進一步通過改變ENO1表達水平來觀察其對鼻咽癌細胞生物學(xué)特性的影響。為進一步明確鼻咽癌的發(fā)病機制奠定良好的基礎(chǔ)。 方法： 1.鼻咽癌中ENO1表達特性的鑒定及臨床意義。 利用免疫組化檢測120例鼻咽癌與40例正常鼻咽中ENO1基因的表達情況。 2.ENO1表達沉默對鼻咽癌細胞HONE1生物學(xué)特性的影響。 熒光定量PCR檢測鼻咽癌細胞系(6個細胞系,5-8F,6-10B,SUNE1,CNE2,CNE1,HONE1)中ENO1的表達情況,篩選高表達ENO1的細胞株。設(shè)計并體外化學(xué)合成針對ENO1基因的小干擾RNA序列,以脂質(zhì)體(lipofectamineTM 2000)為載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株HONE1,采用熒光定量PCR法測定轉(zhuǎn)染后HONE1細胞ENO1及內(nèi)參GAPDH的mRNA表達,測定干擾效率,以篩選出最有效干擾序列。后將最有效的干擾片段轉(zhuǎn)染至HONE1 NPC細胞。熒光定量PCR法檢測ENO1在干擾前后mRNA的變化。以轉(zhuǎn)染細胞系為樣本,利用transwell小室實驗檢測ENO 1被沉默后HONE1細胞體外遷移運動能力的改變,利用Boyden小室實驗檢測ENO1沉默對NPC細胞的侵襲遷移能力的影響；MTT、流式細胞儀檢測ENO1表達水平改變后對NPC細胞增殖、細胞周期分布、細胞凋亡和停泊非依賴性生長能力的影響。 結(jié)果： 1.鼻咽癌中ENO1表達特性的鑒定及臨床意義 (1)免疫組織化學(xué)檢測ENO1蛋白在鼻咽癌組織中的表達：SP免疫組化結(jié)果表明,ENO1表達主要定位在鼻咽癌細胞胞漿中,陽性表達結(jié)果在鏡下呈棕黃色。而在慢性鼻咽炎組織及腫瘤周圍相對正常組織則為弱陽性或陰性表達。我們利用ENO1兔抗人多克隆抗體對1 20例鼻咽癌標本和40例正常鼻咽組織進行了免疫組化檢測,ENO1的高表達率在鼻咽癌組織中為60.0%(72/120),而在正常組織中為27.5%(11/40)(χ2=11.424,p=0.001,)。兩組ENO1的表達具有顯著性差異。而在對臨床分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的分析中,結(jié)果顯示ENO1的表達與臨床分期顯著相關(guān)(χ2=13.919,P=0.003)。臨床T4期組要低于臨床T1-T3期組,即ENO1陽性表達者,多為臨床早中期；ENO1陰性表達者轉(zhuǎn)移發(fā)生率低,多為臨床晚期。但ENO1蛋白蛋白表達與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P0.05)。上述實驗結(jié)果提示我們ENO1在鼻咽癌表達上調(diào),且與轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)。但其表達上調(diào)對于鼻咽癌細胞生物學(xué)特性的影響以及調(diào)控的具體機制仍不明確。 2.ENO1表達沉默對鼻咽癌細胞CNE2生物學(xué)特性的影響 (1)熒光定量PCR檢測：ENO1在鼻咽癌細胞中的表達采用QPCR檢測ENO1基因在鼻咽癌細胞株中的表達情況,結(jié)果單因素方差分析顯示6種細胞株中ENO1的表達差異具有顯著性(F=13.067,P=0.000)。其中篩選出HONE1為高表達ENO1的細胞株,作為下一步實驗的干擾對象。 (2)瞬時轉(zhuǎn)染siRNA-ENO1-2片段入HONE1細胞系。采用MTT法檢測ENO1基因沉默后細胞的體外增殖情況,結(jié)果顯示,與HONE1-NC和HONE1細胞相比,HONE1-siENO1細胞的增殖速度顯著減慢,并且呈時間依賴關(guān)系(F=4.764,P=0.001)。細胞儀檢測兩組細胞的細胞周期分布,結(jié)果顯示兩組細胞的細胞周期分布并無顯著性差異。綜上所述,ENO1表達沉默顯著抑制了鼻咽癌細胞的體外增殖能力。 (3)瞬時轉(zhuǎn)染siRNA-ENO1-2片段入HONE1細胞系。采用Transwell小室檢測ENO1基因被沉默后HONE1細胞體外遷徙運動能力的變化,結(jié)果顯示：結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組細胞運動能力的差異具有顯著性,(t=-3.163,P=0.004)。與空載體對照HONE-NC細胞相比,干擾ENO1后的HONE1細胞穿過膜的細胞數(shù)顯著增加,其運動能力明顯增強。 Boyden小室檢測ENO1基因沉默后HONE1細胞體外侵襲運動能力的改變,結(jié)果顯示,兩組細胞侵襲能力的差異具有顯著性(t=-13.758,P=0.000),與HONE1-NC細胞相比,HONE1-siENO1細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)增加,HONE1-siENO1細胞的侵襲能力顯著增強。以上結(jié)果表明,ENO1基因沉默后顯著提高了鼻咽癌細胞的體外遷移和侵襲能力。 結(jié)論： 1.較正常鼻咽組織,ENO1在鼻咽癌組織中表達明顯上調(diào),且與鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)； 2.ENO1基因沉默后顯著抑制了鼻咽癌細胞的體外增殖,但促進了遷移和侵襲能力。ENO1與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2362244