【摘要】：視神經(jīng)損傷是眼科臨床常見(jiàn)的眼外傷，嚴(yán)重者常導(dǎo)致視力永久性的喪失，是重要的致盲性眼病之一。目前臨床上治療本病主要以藥物為主，如傷后給予大劑量激素的沖擊治療等，但治療效果不明顯，視力恢復(fù)程度較差，而且副作用較多，因此視神經(jīng)損傷的視力恢復(fù)成為眼科界難以攻克的命題，尋找一種有效的治療方法備受眼科學(xué)者的關(guān)注。 視神經(jīng)損傷的病理學(xué)研究證實(shí)視神經(jīng)損傷后的主要病理改變是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)軸索發(fā)生潰變，軸漿運(yùn)輸障礙導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的水腫和凋亡。因此，促進(jìn)視神經(jīng)損傷再生的首要條件為RGCs的存活，研究神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的相關(guān)凋亡機(jī)制并選擇合適的方法對(duì)凋亡加以抑制是其存活的先決條件。 國(guó)內(nèi)外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的研究已經(jīng)趨于白熱化，對(duì)其在各種誘導(dǎo)條件下分化成不同的細(xì)胞，通過(guò)移植治療不同的疾病興趣不減，但應(yīng)用在眼科方面的研究報(bào)道不多。GAP-43是一種神經(jīng)生長(zhǎng)的相關(guān)蛋白，與神經(jīng)發(fā)育與再生密切相關(guān)。本研究將GAP-43與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞這兩者熱門研究結(jié)合到一起，通過(guò)建立了大鼠的視神經(jīng)損傷模型，探究慢病毒介導(dǎo)GAP-43基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠視神經(jīng)損傷的可行性。 第一部分構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的GAP-43過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體 目的： 構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的GAP-43過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體，并在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度。 方法： 1、慢病毒介導(dǎo)的GAP-43過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建以pCDNA-GAP-43為模板，設(shè)計(jì)含NotI和NsiI酶切位點(diǎn)的上下游引物，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和慢病毒載體LV5雙酶切，將酶切產(chǎn)物以T4連接酶連接。感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后挑選正確的克隆酶切鑒定，經(jīng)測(cè)序證實(shí)表達(dá)載體構(gòu)建正確。應(yīng)用Lipofectamine2000三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝慢病毒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后收獲病毒離心過(guò)濾，最后超速離心將沉淀重懸得到病毒儲(chǔ)存液，測(cè)定病毒滴度。2慢病毒介導(dǎo)的shmRNA-GAP-43載體的構(gòu)建構(gòu)建針對(duì)靶基因的四個(gè)干擾質(zhì)粒（Gap43-rat-619、Gap43-rat-844、Gap43-rat-1215、Gap43-rat-678）把這四個(gè)都有特定抗性表達(dá)序列的干擾質(zhì)粒分別與前期構(gòu)建的GAP-43過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，選擇出干擾效果最佳的質(zhì)粒，然后構(gòu)建慢病毒shmRNA-GAP-43克隆載體；用構(gòu)建的慢病毒克隆載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒，收集病毒原液，超速離心濃縮，并測(cè)定滴度。 結(jié)果： 1、經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定慢病毒過(guò)表達(dá)載體LV5-GAP-43序列正確。293T細(xì)胞包裝后收獲了病毒儲(chǔ)存液，病毒滴度為2*108TU/ml。2、干擾載體在293T細(xì)胞中的干擾結(jié)果提示Gap43-rat-619干擾效果最佳，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定慢病毒抑制表達(dá)載體LV3-GAP-43-shRNA序列正確。經(jīng)過(guò)293T細(xì)胞包裝后收獲了病毒儲(chǔ)存液，病毒滴度為2*108TU/ml。 結(jié)論： 成功構(gòu)建GAP-43基因的過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的慢病毒載體，并包裝產(chǎn)生了慢病毒，在293T細(xì)胞中內(nèi)證實(shí)了病毒滴度的高效性。 第二部分慢病毒介導(dǎo)的GAP-43基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。將攜帶GAP-43基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至BMSCs，檢測(cè)其過(guò)表達(dá)水平及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 方法： 單純貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，流式細(xì)胞學(xué)檢查骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志抗原的表達(dá)青況。攜帶GAP-43的慢病毒以MOI=20感染BMSCs后，利用qPCR及Western blot檢測(cè)GAP-43表達(dá)水平。觀察GAP-43基因轉(zhuǎn)染后BMSCs形態(tài)學(xué)變化，行RT-PCR檢測(cè)NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： 培養(yǎng)的BMSCs為多角形或梭形，呈漩渦狀排列生長(zhǎng)。流式細(xì)胞學(xué)檢查細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD90、CD44高表達(dá)，而CD11b、CD34低表達(dá)情況。GAP-43-BMSCs經(jīng)qPCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)有外源性GAP-43表達(dá)。GAP-43基因轉(zhuǎn)染后BMSCs3天，BMSCs胞體開(kāi)始收縮，折光性增強(qiáng)，細(xì)胞有突起伸出，5天時(shí)可見(jiàn)典型的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)改變，RT-PCR檢測(cè)NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA表達(dá)陽(yáng)性。 結(jié)論： 采用單純貼壁法可在體外成功地分離、培養(yǎng)和純化大鼠BMSCs。慢病毒介導(dǎo)的GAP-43能高效感染BMSCs，，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)分化成神經(jīng)樣細(xì)胞。 第三部分抑制GAP-43基因表達(dá)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究 目的： 抑制GAP-43基因表達(dá)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化研究 方法： 應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的GAP-43-shRNA轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，確定特異性篩選藥物嘌呤霉素的濃度，利用qPCR及Western blot檢測(cè)GAP-43表達(dá)水平。觀察視網(wǎng)膜條件分化液條件下shmRNA-GAP-43基因轉(zhuǎn)染后BMSCs形態(tài)學(xué)變化，行RT-PCR檢測(cè)NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： 慢病毒介導(dǎo)的GAP-43-shRNA轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在視網(wǎng)膜條件分化液誘導(dǎo)條件下，qPCR和Western blot檢測(cè)GAP-43、NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulinmRNA的表達(dá)，GAP-43-shRNA組較陰性對(duì)照組（BMSC組）GAP-43的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。 結(jié)論： 抑制GAP-43基因后BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的能力被明顯減弱。 第四部分慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)GAP-43基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠視神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 觀察慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)GAP-43基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠視神經(jīng)損傷的作用及其相關(guān)機(jī)制，期望為視神經(jīng)損傷治療提供新思路，探索一條新途徑。 方法： 采用鉗夾視神經(jīng)法建立大鼠視神經(jīng)損傷模型。120只大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組（Sham組）、溶劑對(duì)照組（PBS組）、空載慢病毒組（GFP/BMSCs組）、GAP-43重組慢病毒組（GAP-43/BMSCs組）和shRNA-GAP-43/BMSCs重組慢病毒組（shRNA-GAP-43/BMSCs組），每組24只，按術(shù)后3天、7天、14天、28天均分為4個(gè)亞組，將5ul1×PBS溶液或1×105/眼細(xì)胞數(shù)注射到視網(wǎng)膜下腔。HE染色觀察細(xì)胞移植后視網(wǎng)膜病理變化。采用Western-blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜GAP-43蛋白表達(dá)，Realtime PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織GAP-43mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果： 在視神經(jīng)損傷模型建立后第3、7、14、28日，GAP-43/BMSCs組的視網(wǎng)膜病理改變均明顯輕于其他各組。此外，與sham組，PBS組、GFP/BMSCs組、shRNA-GAP-43/BMSCs組相比，GAP-43/BMSCs組視網(wǎng)膜組織GAP-43基因的mRNA及蛋白表達(dá)表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.05）。 結(jié)論： 成功構(gòu)建大鼠視神經(jīng)損傷模型。慢病毒介導(dǎo)的GAP-43轉(zhuǎn)染BMSCs移植到視網(wǎng)膜下腔可以高效表達(dá)GAP-43基因，在神經(jīng)修復(fù)過(guò)程中起到了一定的作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R779.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 單志新;林秋雄;李曉紅;鄧春玉;周志凌;黃薇;黃曉忠;余細(xì)勇;;腺病毒表達(dá)載體對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年07期

2 孫吉平,賈延R

本文編號(hào)：2353490