【摘要】：目的構(gòu)建靶向大鼠G蛋白偶聯(lián)受體91(G protein-coupled receptor 91,GPR91)基因的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體,探討GPR91受體對高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)釋放的調(diào)節(jié)作用。方法設(shè)計合成4對針對大鼠GPR91(NM_001001518)的特異性單鏈寡核苷酸鏈,兩端分別引入Age I和EcoR I酶切位點,退火后得到小片段帶黏性末端的雙鏈DNA,克隆入慢病毒載體pGCSIL-GFP,行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和DNA測序鑒定重組體。將各慢病毒shRNA干擾載體和輔助包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集病毒顆粒并行濃縮滴度檢測。將各慢病毒載體轉(zhuǎn)染RGC-5細胞后,Western blot法篩選有效的慢病毒shRNA干擾載體。使用45 mmol·L-1的高糖刺激RGC-5細胞24 h,用ELISA法觀察干擾GPR91后VEGF的表達情況。結(jié)果 PCR及DNA測序結(jié)果均顯示慢病毒載體pGCSIL-GFP-shGPR91構(gòu)建正確;包裝病毒顆粒后,pGCSIL-GFP-shGPR91-1、2、3、4組病毒濃縮液的滴度依次為1.5×109 TU·mL-1、1.5×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1。將慢病毒顆粒感染RGC-5細胞后,Western blot檢測顯示NC組GPR91蛋白(0.60±0.08)空白組(0.62±0.07)的表達無明顯差異(F=49.03,P0.05)。而與空白組相比,4個慢病毒載體組(0.48±0.05、0.34±0.06、0.30±0.04和0.11±0.06)均能不同程度沉默GPR91的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.03,P0.01),其中pGCSIL-GFP-shGPR91-3干擾效率最高。ELISA結(jié)果顯示空白組、高糖組、高糖+NC組、高糖+pGCSIL-GFP-shGPR91-3組VEGF蛋白表達分別為(25.63±4.52)pg·mL-1、(72.74±8.24)pg·mL-1、(71.68±8.31)pg·mL-1和(46.77±6.21)pg·mL-1,表明GPR91病毒干擾載體可顯著降低高糖引起的VEGF分泌,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.852,P0.01)。結(jié)論本實驗成功構(gòu)建了靶向大鼠GPR91的shRNA慢病毒載體并進行病毒顆粒包裝。所構(gòu)建的慢病毒載體能夠降低高糖作用下的VEGF表達,為進一步研究GPR91基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用機制和動物基因治療奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct a small hairpin RNA (small hairpin RNA,shRNA lentivirus vector targeting G-protein coupled receptor 91 (G protein-coupled receptor 91) gene in rats and to explore the effect of GPR91 receptor on vascular endothelial growth factor (vascular endothlial growth factor, induced by high glucose. VEGF). Methods four pairs of specific single-stranded oligonucleotide chains targeting rat GPR91 (NM_001001518) were designed and synthesized. Age I and EcoR I restriction sites were introduced at both ends, respectively. After annealing, small fragments of double-stranded DNA, with adhesive ends were cloned into lentivirus vector pGCSIL-GFP,. The recombinant was identified by polymerase chain reaction (polymerase chain reaction,PCR) and DNA sequencing. The lentivirus shRNA interference vector and the auxiliary packaging vector were co-transfected into 293T cells and the virus particles were collected and the titer concentration was detected. The lentivirus shRNA interference vectors were screened by, Western blot after transfection of lentivirus vectors into RGC-5 cells. RGC-5 cells were stimulated with 45 mmol L-1 of high glucose for 24 h. The expression of VEGF was observed by ELISA method after GPR91 interference. Results the results of PCR and DNA sequencing showed that the construction of lentivirus vector pGCSIL-GFP-shGPR91 was correct. After packaging virus particles, the titer of pGCSIL-GFP-shGPR91-1,2,3,4 group virus concentrate was 1.5 脳 10 ~ 9 TU mL-1,1.5 脳 10 ~ 9 TU mL-1,3.0 脳 10 ~ 9 TU mL-1.. The expression of GPR91 protein in NC group (0.60 鹵0.08) was not significantly different from that in blank group (0.62 鹵0.07) after lentivirus particles were infected with RGC-5 cells (P 0.05). Compared with the blank group, the four lentivirus vector groups (0.48 鹵0.05) (0.48 鹵0.05) (0.30 鹵0.04) and 0.11 鹵0.06 (0.11 鹵0.06) were able to silence the expression of GPR91 in different degrees, and the difference was statistically significant (F _ (49.03) P _ (0.01). PGCSIL-GFP-shGPR91-3 interference efficiency was the highest. ELISA results showed that the expression of VEGF protein in blank group, high glucose NC group and high glucose pGCSIL-GFP-shGPR91-3 group was (25.63 鹵4.52) pg mL-1, respectively. (72.74 鹵8.24) pg mL-1, (71.68 鹵8.31) pg mL-1 and (46.77 鹵6.21) pg mL-1, showed that GPR91 virus interference vector could significantly reduce VEGF secretion induced by high glucose. P0.01) Conclusion the shRNA lentivirus vector targeting rat GPR91 was successfully constructed and packaged. The constructed lentivirus vector can reduce the expression of VEGF in diabetic retinopathy and lay a foundation for further study on the role of GPR91 gene in diabetic retinopathy and animal gene therapy.
【作者單位】： 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部;上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院眼科;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(編號:81070738) 上海市自然科學(xué)基金(編號:11JC1407702)~~
【分類號】：R587.2;R774.1

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本文編號：2335030