【摘要】： 目的:構(gòu)建survivin shRNA干擾質(zhì)粒載體,用于轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2,體內(nèi)、體外觀察suvivin shRNA表達(dá)載體對CNE2細(xì)胞survivin基因/蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和放射敏感性的影響,從而為臨床鼻咽癌的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:①根據(jù)survivin的cDNA序列設(shè)計構(gòu)建survivin shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivin及陰性對照重組質(zhì)粒pGenesil-1-HK,經(jīng)酶切和測序鑒定正確后,分別提取兩重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞;②實(shí)驗(yàn)分為空白對照CNE2細(xì)胞組(簡稱CNE)、陰性對照重組質(zhì)粒pGenesil-1-HK組(簡稱HK)和survivin shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivin組(簡稱SURVIVIN),分別進(jìn)行體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn);③瞬時轉(zhuǎn)染48h時,FCM檢測細(xì)胞凋亡,RT-PCR測定survivin mRNA表達(dá),以觀察survivin shRNA表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染CNE2 48h后對survivin基因表達(dá)的抑制作用;④G418篩選獲得各重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞,RT-PCR測定survivin mRNA表達(dá),FCM和Western-blotting檢測蛋白表達(dá),MTT測定細(xì)胞增殖能力;克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞放射敏感性;⑤將各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞接種BALB/c nu/nu裸鼠,建立荷瘤裸鼠模型;通過觀測成瘤時間、瘤體積和瘤重量,免疫組化測定survivin蛋白表達(dá)等方法,研究survivin shRNA對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長的抑制作用。 結(jié)果:①酶切和測序鑒定結(jié)果表明,成功構(gòu)建survivin shRNA重質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-1-survivin和陰性對照質(zhì)粒pGenesil-1-HK;②瞬時轉(zhuǎn)染48h時,凋亡指數(shù)結(jié)果為:空白對照組(3.57±0.34)% ; pGenesil-1-HK組(3.77±0.33)% ;pGenesil-1-survivin組(6.33±0.37)%;pGenesil-1-survivin組的凋亡指數(shù)是空白對照組的1.78倍(P0.05);pGenesil-1-survivin組survivin mRNA表達(dá)的抑制率為63.53%,與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而陰性對照pGenesil-1-HK組與空白對照組間無明顯差異(P0.05);③G 418成功篩選出各重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CNE2細(xì)胞,FCM測得各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分率均達(dá)85%以上;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-1-survivin組CNE2細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)抑制率為64.55%,與空白對照組及陰性對照pGenesil-1-HK組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);FCM及Western-blotting檢測survivin蛋白表達(dá)抑制率分別為50.29%和51.24%,兩結(jié)果基本符合,且與空白對照組及陰性對照pGenesil-1-HK組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);④細(xì)胞增殖速度的比較表明,pGenesil-1-survivin組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力明顯抑制;⑤克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)survivin shRNA表達(dá)載體pGenesil-1-survivin沉默survivin基因表達(dá)后,可提高人鼻咽癌CNE2細(xì)胞的放射敏感性;⑥pGenesil-1-survivin組移植瘤較空白對照組及陰性質(zhì)粒pGenesil-1-HK組的平均成瘤時間延遲,平均瘤體積、重量明顯下降(P0.05),切片的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)pGenesil-1-survivin組survivin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論:成功構(gòu)建survivin shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivin ;pGenesil-1-survivin重組質(zhì)粒能在體內(nèi)、外干擾人鼻咽癌CNE2細(xì)胞survivin基因表達(dá),抑制CNE2細(xì)胞增殖,提高CNE2細(xì)胞放射敏感性;5’-GGACCACCGCATCTCTACA-3’可作為人鼻咽癌CNE2細(xì)胞survivin基因的RNA干擾靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李雙利,劉俊江,李守賓,李曉強(qiáng);Survivin在泌尿系統(tǒng)移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年04期

2 姚紅兵,吳愛國,黃宗海;Survivin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年12期

3 劉川;畢峰;楊明妍;羅速;;RNA干擾Survivin基因在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中的作用[J];中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2010年08期

4 唐發(fā)清,曹亞;Survivin研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).生理.病理科學(xué)與臨床分冊;2001年02期

5 施國偉,潘煜海;Survivin與泌尿系腫瘤[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;2003年02期

6 劉祺;survivin與消化系統(tǒng)腫瘤[J];中國普通外科雜志;2003年11期

7 徐詠蓮,劉少陽,江大瓊;宮頸癌中survivin的表達(dá)及臨床意義[J];腫瘤防治研究;2004年03期

8 李建莎,吳煥明,邢銘友;Survivin,Ki67,PCNA和FⅧRAg在非霍奇金淋巴瘤表達(dá)及意義[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年02期

9 濮德敏,程彥君,黃玲,姚冬梅,辛?xí)詬?凋亡抑制蛋白Survivin在增生性子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2004年02期

10 別俊,孫茂盛,孫強(qiáng)明,鄭建平,孫雯佳;人survivin的克隆、在大腸桿菌中的表達(dá)及活性鑒定[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年08期

相關(guān)會議論文 前10條

1 楊華安;;靶向survivin的siRNA干擾膀胱腫瘤EJ細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[A];第十五屆全國泌尿外科學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

2 李大偉;;P糖蛋白、Survivin在喉鱗癌中表達(dá)與細(xì)胞增殖、凋亡及預(yù)后的關(guān)系[A];第十次全國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

3 包琳;;中醫(yī)藥對肝癌Survivin基因表達(dá)影響的研究探討[A];第五屆中國中西醫(yī)結(jié)合圍手術(shù)期醫(yī)學(xué)研討會論文集[C];2010年

4 ;A Single Amino Acid Change(Asp 53→Ala53) Converts Survivin from anti-apoptotic to proapoptotic[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第八屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

5 呂喜英;;Survivin與CD105在肺癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[A];中國(第七屆)腫瘤微創(chuàng)治療學(xué)術(shù)大會暨世界影像導(dǎo)引下腫瘤微創(chuàng)治療學(xué)會成立籌備大會論文匯編[C];2011年

6 王曉娟;戴國儀;曹利民;朱慧芬;張悅;邵靜芬;楊敬;沈關(guān)心;;Survivin反義核酸促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[A];中國免疫學(xué)會第四屆學(xué)術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

7 富凱;楊軍;汪欣;許波;;對腺樣囊性癌(SACC)細(xì)胞Survivin基因不同靶序列設(shè)計siRNA特異性的篩選[A];第八次全國口腔頜面—頭頸腫瘤會議論文匯編[C];2009年

8 王曉娟;趙曉萍;朱慧芬;張悅;邵靜芳;楊敬;沈關(guān)心;;Survivin反義核酸促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[A];湖北省暨武漢市免疫學(xué)會第八屆學(xué)術(shù)會議論文集[C];2003年

9 孫慧;馬杰;孫玲;劉林湘;鄒典斌;劉少君;;Survivin、Bcl-2和VEGF在骨髓增生異常綜合征中的表達(dá)及其相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

10 張青云;李雪峰;徐建軍;王雅明;;尿液中Survivin酶聯(lián)免疫方法的建立及膀胱癌檢測的初步應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者　耿建擴(kuò) 藺玉堂;“表達(dá)凝血八因子新的重組質(zhì)�！背晒ρ兄芠N];光明日報;2006年

2 嚴(yán)少慰;查游離DNA 肺癌有望早發(fā)現(xiàn)[N];健康報;2008年

3 ;丹參能顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Survivin表達(dá)[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

4 吳一福;四軍醫(yī)大成功建立HCV多表位基因P815細(xì)胞系[N];中國醫(yī)藥報;2006年

5 張中橋;反義Cortactin基因能抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[N];中國醫(yī)藥報;2006年

6 紹興縣柯橋中學(xué) 陶志堅;限制性核酸內(nèi)切酶相關(guān)知識總結(jié)[N];學(xué)知報;2011年

7 ;抗肝纖維化治療期待突破[N];中國醫(yī)藥報;2006年

8 王民全;我國畜禽基因工程疫苗技術(shù)體系建設(shè)進(jìn)展迅速[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2005年

9 胡宇芬邋通訊員 周文燕;科學(xué)探索允許失敗[N];湖南日報;2007年

10 吳一福;川大成功建立人新基因PCIA1細(xì)胞株[N];中國醫(yī)藥報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馬靜;RNA干擾抑制survivin基因表達(dá)誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

2 楊彤濤;凋亡抑制基因survivin在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及其RNA干涉的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 曹永倩;紫杉醇及survivin反義寡核苷酸對惡性黑色素瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2010年

4 范海濤;Survivin與VEGF的檢測及二者反義寡核苷酸對膀胱癌的治療研究[D];吉林大學(xué);2010年

5 李紅玲;Survivin在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)及其反義寡核苷酸對淋巴瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 朱曉東;Survivin在紫杉醇抗腫瘤機(jī)制中作用及其反義核酸干預(yù)胃癌形成的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

7 閆歌;RNA干擾沉寂survivin表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞凋亡和相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

8 史惠蓉;Survivin在卵巢癌中的表達(dá)及其反義核酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2004年

9 馬愛妞;SurKex誘導(dǎo)survivin基因沉默的分子機(jī)理研究[D];上海交通大學(xué);2010年

10 吳荒;Survivin-siRNA抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王玉;shRNA沉默survivin基因抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2010年

2 趙楊;Caspase-3 mRNA和Survivin mRNA在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其臨床意義[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

3 王霞;survivin和hTERT在大腸粘膜癌變中表達(dá)及其與c-mye關(guān)系[D];鄭州大學(xué);2004年

4 劉洪翔;Survivin 在結(jié)直腸腺瘤癌變過程中的表達(dá)及其與p53、Ki-67表達(dá)的關(guān)系[D];鄭州大學(xué);2004年

5 管睿;Rab、Survivin在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 趙蒙;Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對肝門部膽管癌細(xì)胞株FRH-0201侵襲作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2010年

7 張秀梅;Survivin反義寡核苷酸對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響[D];南華大學(xué);2010年

8 孔令慧;非小細(xì)胞肺癌中E2F-1、Survivin蛋白表達(dá)及與HPV感染的相關(guān)性研究[D];華中科技大學(xué);2009年

9 郭文佳;與Survivin調(diào)控相關(guān)的六個因子在新疆哈薩克族食管癌中的表達(dá)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2010年

10 林青;白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對紫杉醇誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞存活素survivin表達(dá)的拮抗作用及促凋亡作用[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2011年

，

本文編號：2334850