【摘要】：第一部分PMCA2及其A端和C端剪接變異體在新生大鼠耳蝸的表達(dá) 目的研究質(zhì)膜鈣ATP酶異構(gòu)體2(Plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2,PMCA2)及其A端和C端剪接變異體在新生大鼠耳蝸的表達(dá)。 方法(1)取出生3-4天(P3-P4)的大鼠,斷頭后分離出耳蝸,固定包埋后做冰凍切片。同時(shí),分離出耳蝸基底膜做鋪片。通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)PMCA2在耳蝸切片以及基底膜的表達(dá)。(2)依次從P3-P4大鼠分離基底膜(BM,包含Corti’s器,下同)、螺旋神經(jīng)節(jié)(SG)、螺旋韌帶(SL,包含血管紋,下同)以及完整的耳蝸組織,Trizol法提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,分別通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PMCA2的A端和C端剪接變異體在上述耳蝸組織中的表達(dá)。(3)取同樣年紀(jì)的大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)組織,體外培養(yǎng)后用神經(jīng)元標(biāo)志物抗神經(jīng)微絲蛋白200抗體(NF-200)鑒定。通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)PMCA2在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGCs)的表達(dá)情況;收集體外培養(yǎng)的SGCs,Trizol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,分別通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)PMCA2 A端和C端的剪接變異體的表達(dá)。(4)分別分離BM、SG、SL以及完整耳蝸組織,提取總蛋白后制備電泳凝膠,跑10% SDS-PAGE,之后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1h后加入兔抗PMCA2抗體(1:1000),4℃條件下孵育過(guò)夜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:2500),室溫下孵育1h,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。 結(jié)果(1) PMCA2在外毛細(xì)胞(OHCs)纖毛、SG、血管紋(SV)均有強(qiáng)烈表達(dá);在Reissner’s membrane (RM)表達(dá)較弱,偶爾在內(nèi)毛細(xì)胞(IHCs)纖毛有表達(dá)。(2)毛細(xì)胞纖毛所表達(dá)的PMCA2剪接變異體是w/a, SG的是z/b和z/c,SV是w/a和w/c。另外在整個(gè)耳蝸組織中,檢測(cè)到PMCA2的A端剪接變異體為w、y和z,C端的為a、b和c。(3)體外培養(yǎng)的SGCs胞體透亮,活性良好, NF-200免疫陽(yáng)性。SGCs的胞膜、胞質(zhì)和軸突均發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光,表明PMCA2免疫陽(yáng)性。RT-PCR結(jié)果表明SGCs所表達(dá)的A端剪接變異體為PMCA2z,而C端的剪接變異體為PMCA2b和PMCA2c。(4)通過(guò)Western blot方法,用PMCA2抗體可以檢測(cè)到耳蝸組織中PMCA2的C端剪接方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BM和SV表達(dá)剪接體PMCA2a, SG表達(dá)PMCA2b,而整個(gè)耳蝸組織表達(dá)PMCA2a和PMCA2b,這與PCR結(jié)果一致。 結(jié)論P(yáng)MCA2在新生大鼠耳蝸組織有不同水平的表達(dá),其A端和C端的剪接變異體也存在差異性表達(dá)。 第二部分PMCA亞型在發(fā)育大鼠耳蝸毛細(xì)胞的分布 目的研究質(zhì)膜鈣泵亞型1-3(PMCA1-3)和5F10在發(fā)育大鼠耳蝸毛細(xì)胞的分布。 方法(1)麻醉后取出生0-21天的大鼠耳蝸,固定后分離出基底膜做鋪片,通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)PMCA亞型的分布情況。依次用0.5% Triton X-100破膜、10%正常山羊血清封閉后加入兔抗PMCA1-3或5F1(0一種能識(shí)別所有PMCA亞型的抗體)(1:1000),4℃條件下孵育過(guò)夜, PBS漂洗后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔二抗(1: 400),在室溫下孵育2h, PBS洗滌后加入Alexa Fluor 568標(biāo)記的鬼比環(huán)肽phalloidin(1:200),在室溫下孵育1h,PBS漂洗后封片。將共聚焦顯微鏡所有設(shè)置調(diào)節(jié)到同樣的位置,觀察基底膜染色情況。使用Photoshop或Image J軟件測(cè)量毛細(xì)胞的免疫熒光強(qiáng)度,繪年齡相關(guān)性表達(dá)曲線。(2)通過(guò)免疫金標(biāo)法檢測(cè)PMCA2和5F10在成年大鼠耳蝸毛細(xì)胞的表達(dá)。依次固定、破膜、封閉后加入用含1%胎牛血清(BSA)和0.02% Tween 20的0.05M TBS溶液(BSA-T20-TBS)稀釋的一抗PMCA2或5F10(1:50),漂洗后加入用BSA-T20-TBS稀釋的結(jié)合有15nm金標(biāo)顆粒的羊抗兔IgG二抗(1:20),在室溫下孵育2h,洗滌后用水樣乙酸雙氧鈾染色20min,在透射電子顯微鏡下觀察標(biāo)記情況。 結(jié)果(1)在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,PMCA1在OHCs和IHCs纖毛均沒(méi)有表達(dá)。在出生后的6天內(nèi),PMCA1在OHCs和IHCs的胞體均有表達(dá),之后在OHCs胞體的表達(dá)水平逐漸下降,到成年期幾乎全部消失。而在IHCs胞體,PMCA1的表達(dá)逐漸增強(qiáng),進(jìn)入成年期才保持穩(wěn)定水平。(2)剛出生的第一周,PMCA2在OHCs纖毛的表達(dá)快速增強(qiáng),首先出現(xiàn)在底回OHCs纖毛,然后是中回,最后是頂回,底回的表達(dá)強(qiáng)于頂回。到了P8,PMCA2在OHCs纖毛的表達(dá)基本達(dá)到成年水平,頂回、中回和底回之間沒(méi)有明顯的區(qū)別。在出生后10天內(nèi), PMCA2在IHCs纖毛有微弱的表達(dá),但到P13后基本消失。在整個(gè)發(fā)育階段,PMCA2在OHCs和IHCs的胞體均沒(méi)有表達(dá)。(3)在整個(gè)發(fā)育過(guò)程,PMCA3在OHCs和IHCs纖毛沒(méi)有表達(dá),但在出生6天內(nèi)在OHCs和IHCs胞體均有表達(dá)。到P13以后,PMCA3在OHCs胞體的表達(dá)基本消失,在IHCs胞體的表達(dá)雖然稍有下降,但仍處于較高水平,并維持到成年期。(4)5F10在OHCs和IHCs纖毛的表達(dá)模式和PMCA2的相似。5F10在OHCs和IHCs胞體的表達(dá)在出生后6天逐漸增強(qiáng),之后逐漸下降,在OHCs胞體的表達(dá)到成年期幾乎消失,在IHCs胞體的表達(dá)卻相反,仍維持在一定的水平進(jìn)入成年。(5)免疫金標(biāo)結(jié)果顯示,PMCA2在成年大鼠耳蝸OHCs的3排靜纖毛上分布的金標(biāo)顆粒數(shù)量相差不明顯。PMCA2和5F10在OHCs纖毛上分布的金標(biāo)顆粒數(shù)量分別是IHCs纖毛的3.8倍和2倍。PMCA2在頂回OHCs纖毛分布的金標(biāo)顆粒數(shù)量與底回的沒(méi)明顯區(qū)別。 結(jié)論P(yáng)MCA2在OHCs纖毛開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間(P0-P6)和機(jī)械電轉(zhuǎn)導(dǎo)電流出現(xiàn)時(shí)間是一致的。PMCA2在IHCs纖毛的表達(dá)弱于OHCs纖毛,表明IHCs的Ca2+負(fù)荷比OHCs小。PMCA2在成年大鼠頂回和底回OHCs纖毛的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。PMCA1和PMCA3主要分布于IHCs胞體。5F10在P2-P6大鼠的IHCs胞體的表達(dá)變化符合IHCs胞體的Ca2+電流變化。由于毛細(xì)胞主要依靠PMCA來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平,因此這種差異性表達(dá)可能是由于PMCA的不同亞型在毛細(xì)胞發(fā)揮著特殊的功能。 第三部分PMCA亞型在新生大鼠耳蝸基底膜的表達(dá) 目的通過(guò)Western blot方法比較質(zhì)膜鈣泵亞型1-3(PMCA1-3)在P2和P8大鼠耳蝸基底膜的表達(dá)差異,并檢測(cè)PMCA2在P8大鼠耳蝸毛細(xì)胞的表達(dá)量。 方法(1)分別取出生2天和8天的健康SD大鼠各4只,麻醉后分離出BM,剔除RM和TM,提取總蛋白后測(cè)量蛋白濃度,分別上樣3μg和5μg總蛋白,跑7.5 % SDS-PAGE,之后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2h后加入PMCA2抗體(1:1000),4℃條件下孵育過(guò)夜,洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:2000),室溫孵育1h,洗滌后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。(2)分別取P2和P8大鼠基底膜,提取總蛋白后,分別上樣20μg總蛋白跑7.5 % SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后分別加兔抗PMCA1-3抗體(1:1000),其余步驟同(1)。(3)分別上樣P8大鼠基底膜總蛋白5μg、10μg和20μg,以及100ng、400ng和800ng BSA蛋白作為對(duì)照組,跑7.5 % SDS-PAGE。跑完電泳后將膠分為2部分,部分泳道(含10μg和20μg總蛋白以及100 ng、400 ng和800ng BAS蛋白)用于SYPRO染膠。另一部分泳道(含5μg總蛋白)用來(lái)做Western blot,檢測(cè)PMCA2的表達(dá),具體步驟同(1)。通過(guò)對(duì)比SYPRO染膠后的條帶和Western blot實(shí)驗(yàn)后底片上的條帶,確定PMCA2條帶位置,用Photoshop或Image J軟件測(cè)量其灰度值,通過(guò)計(jì)算得出該條帶的PMCA2含量。 結(jié)果(1)PMCA2在P2和P8大鼠BM均有表達(dá),在P8的含量高于在P2的。(2) PMCA1在P2和P8大鼠BM有微弱的表達(dá),兩者之間沒(méi)有明顯差別;PMCA2在P2和P8大鼠BM的含量非常豐富;PMCA3在P2和P8大鼠的BM幾乎沒(méi)有表達(dá)。(3)PMCA2在單個(gè)P8大鼠BM的含量約為2.5 ng。 結(jié)論P(yáng)MCA1-3在P2和P8的BM有著不同的表達(dá)水平。PMCA1表達(dá)較弱,PMCA2有著強(qiáng)烈的表達(dá),并與年齡的增長(zhǎng)呈正相關(guān),PMCA3無(wú)明顯表達(dá)。PMCA1-3在新生大鼠基底膜不同的分布說(shuō)明了耳蝸毛細(xì)胞對(duì)這幾種PMCA亞型有著特殊的Ca2+調(diào)節(jié)需求。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R764

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本文編號(hào)：2330969