【摘要】：第一部分STAT3信號(hào)通路調(diào)控耳蝸毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 目的： 由于衰老、噪音和耳毒性藥物導(dǎo)致的毛細(xì)胞不可逆損傷和缺失凋亡是致人類聽(tīng)力下降和平衡功能障礙的主要因素,聽(tīng)力下降已經(jīng)是美國(guó)老年群體發(fā)病率第三高疾病。哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞的不可再生性是耳聾治療困境之一,通過(guò)刺激毛細(xì)胞再生來(lái)重建聽(tīng)覺(jué)器官結(jié)構(gòu)和功能是治療聽(tīng)力損失的理想選擇。小鼠耳蝸基底膜體外培養(yǎng)模型是研究毛細(xì)胞再生簡(jiǎn)單有效的手段。在促進(jìn)毛細(xì)胞再生藥物篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一種STAT3信號(hào)通路激活劑SD19可以促進(jìn)P0/1階段CD1小鼠耳蝸毛細(xì)胞數(shù)目增多,進(jìn)一步研究表明其機(jī)制為促進(jìn)支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究在小鼠耳蝸基底膜體外培養(yǎng)體系應(yīng)用此種化合物,以期探索STAT3通路在哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞再生中作用及機(jī)制,從而為哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)上皮毛細(xì)胞再生提供研究新方向,為藥物促進(jìn)毛細(xì)胞再生提供理論依據(jù)。 方法： 1)探索新生CD1小鼠耳蝸基底膜和螺旋韌帶體外共培養(yǎng)的模型,摸索不破壞毛細(xì)胞和支持細(xì)胞存活的培養(yǎng)條件,進(jìn)一步探索不同濃度STAT3通路激活劑SD19對(duì)毛細(xì)胞影響； 2)在不同年齡段新生CD1小鼠耳蝸基底膜和螺旋韌帶體外共培養(yǎng)的模型中使用STAT3通路激活劑SD19,探索STAT3通路在不同發(fā)育階段耳蝸中作用； 3)研究在正常CD1小鼠和新霉素?fù)p傷毛細(xì)胞不同情況下,STAT3通路激活劑SD19的作用； 4)在新生CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中聯(lián)合使用STAT3通路抑制劑,進(jìn)一步確定STAT3通路作用； 5)在新生CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中利用FM1-43標(biāo)記原始耳蝸毛細(xì)胞,再使用STAT3通路激活劑SD19,探究新生毛細(xì)胞的來(lái)源； 6)使用培養(yǎng)的Sox-2CreER+/-tdTomato轉(zhuǎn)基因鼠來(lái)研究新生毛細(xì)胞來(lái)源,培養(yǎng)基中加入Tomaxifen激活Cre從而所有的支持細(xì)胞表達(dá)Tomato,觀察新生毛細(xì)胞是否是支持細(xì)胞來(lái)源； 7)研究CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中使用STAT3通路激活劑SD19之后相關(guān)基因表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1)4μM和8μM的STAT3通路激活劑SD19可以明顯增加新生P0/1階段CD1小鼠頂圈和中圈耳蝸毛細(xì)胞數(shù)目,所有濃度對(duì)P3、P5階段耳蝸毛細(xì)胞沒(méi)有明顯效果。新霉素?fù)p傷和正常處理均未見(jiàn)有Edu陽(yáng)性細(xì)胞,毛細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯改變。聯(lián)合使用STAT3抑制劑則未見(jiàn)毛細(xì)胞增多。在應(yīng)用STAT3通路激活劑SD19之后可以發(fā)現(xiàn)更多FM1-43陰性而Myo7a陽(yáng)性細(xì)胞,進(jìn)一步證明新生毛細(xì)胞產(chǎn)生。Lineage tracing結(jié)果表明新生毛細(xì)胞是支持細(xì)胞起源。 2)P0階段CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中加入8μM的STAT3通路激活劑SD19可以上調(diào)Stat3和JaM基因來(lái)激活STAT3通路,同時(shí)上調(diào)Hesl基因、Mathl基因、抑制Notch基因,提示增多的毛細(xì)胞來(lái)自于轉(zhuǎn)分化。 結(jié)論： 通過(guò)本研究,證實(shí)了STAT3通路在小鼠新生耳蝸毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中發(fā)揮作用,激活STAT3通路可以促進(jìn)支持細(xì)胞向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。STAT3通路對(duì)Notch通路有一定的調(diào)控作用。 第二部分Pmca2突變小鼠的內(nèi)耳基因治療 目的： NIDCD數(shù)據(jù)表明17%美國(guó)成人患有聽(tīng)力下降,其中由上百種基因突變引起的遺傳性耳聾目前沒(méi)有治療方法。內(nèi)耳的外源性基因的導(dǎo)入和基因治療,為耳聾的治療帶來(lái)了新的手段。腺病毒及腺相關(guān)病毒是內(nèi)耳基因治療常見(jiàn)的載體,但不同亞型可以轉(zhuǎn)染不同類型細(xì)胞。Pmca2是外毛細(xì)胞纖毛上鈣通道ATP酶,其功能缺陷則導(dǎo)致鈣離子在胞內(nèi)蓄積,最終造成聽(tīng)力喪失。無(wú)論是純合還是雜合型成年P(guān)mca2基因突變小鼠均表現(xiàn)為重度耳聾。首先篩選能夠特異性轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞的病毒,然后體外克隆Pmca2基因,將外源性Pmca2基因?qū)胄律鶳mca2突變鼠內(nèi)耳,通過(guò)干預(yù)遺傳性耳聾動(dòng)物模型毛細(xì)胞基因來(lái)表達(dá)探索從基因水平治療遺傳性耳聾。 方法： 1)使用納升2010顯微操作注射系統(tǒng),向小鼠中圈附近中階注射攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)的6種不同血清型的AAV(AAV2.2-CMV-eGFP,A-AV2.2-CASI-eGFP,AAV2.8-CMV-eGFP,AAV2.8-CASI-eGFP,AAV2.9-CMV-eGFP,AAV2.9-CASI-eGFP)和1種攜帶綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein EGFP)腺病毒(Ad5-CMV-GFP),在內(nèi)耳注射3d,5d,1w,2w,lm后取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片,觀察EGFP或GFP表達(dá)情況； 2)將能夠轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞的AAV2.8-CMV-eGFP,AAV2.9-CMV-eGFP顯微注射入新生野生型小鼠(P0/P1)右側(cè)耳蝸中圈附近中階,6w后使用ABR和DPOAE評(píng)價(jià)雙側(cè)聽(tīng)力； 3)克隆Pmca2質(zhì)粒,并分別包裝進(jìn)／kAV2.8-CMV和Ad5-CMV-GFP病毒； 4)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)載Pmca2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞系,AAV2.8-CMV-Pmca2-HA和Ad5-CMV-Pmca2-GFP轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞系,通過(guò)免疫組化和Western Blot評(píng)價(jià)病毒的功效； 5)在新生的Pmca2突變小鼠(P0-P1)右側(cè)中階注射AAV2.8-CMV-Pmca2-HA或Ad5-CMV-Pmca2-GFP0.3和0.6μL,在注射后的1w、6w分別取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片,并在6w使用ABR和DPOAE評(píng)價(jià)雙側(cè)聽(tīng)力。 結(jié)果： 1)新生鼠在中階注射后1w后,AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP以及Ad5-CMV-GFP組可見(jiàn)支持細(xì)胞、毛細(xì)胞、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭感覺(jué)細(xì)胞表達(dá)GFP,至少持續(xù)表達(dá)2m以上； 2)野生型新生鼠中階注射AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP,6w后,相比對(duì)側(cè)耳,注射耳聽(tīng)力下降0-15dB； 3)Pmca2質(zhì)粒可以通過(guò)與Lipofectamine2000形成脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞系并產(chǎn)生Pmca2蛋白,AAV2.8-CMV-Pmca2-HA不能轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞系,Ad5-CMV-Pmca2-GFP轉(zhuǎn)染并表達(dá)Pmca2基因； 4)新生Pmca2基因突變小鼠(P0-P1)中階注射入AAV2.8-CMV-Pmca2-HA不能檢測(cè)到HA標(biāo)記； 5)Ad5-CMV-Pmca2-GFP之后,1w后基底膜鋪片免疫組化結(jié)果表明Pmca2在毛細(xì)胞表達(dá),但6w后聽(tīng)力無(wú)明顯改善,免疫組化結(jié)果表明部分少數(shù)細(xì)胞表達(dá)Pmca2。 結(jié)論： 1)采用經(jīng)中階入路顯微注射5型腺病毒攜帶目的基因?qū)胄律竽軌驅(qū)⒛康幕虺晒D(zhuǎn)染至耳蝸組織并表達(dá)； 2)采用經(jīng)中階顯微注射AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP攜帶目的基因?qū)胄律竽軌驅(qū)⒛康幕虺晒D(zhuǎn)染至耳蝸組織并表達(dá),并且新生鼠只有輕微的聽(tīng)力下降； 3)腺相關(guān)病毒對(duì)耳蝸毛細(xì)胞沒(méi)有毒性,并最少可以有效轉(zhuǎn)染兩個(gè)月,但其包裝能力有限,腺病毒對(duì)毛細(xì)胞有一定毒性； 4)腺相關(guān)病毒的包裝能力有限,無(wú)法完全包裝Pmca2基因; 5)腺病毒可以運(yùn)載外源性Pmca2在小鼠耳蝸毛細(xì)胞表達(dá),但能否使Pmca2突變鼠功能恢復(fù)還有待研究；
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.43

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2321366