【摘要】：角膜緣區(qū)是角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells, LSCs)的所在之處,也是角結(jié)膜間重要的屏障結(jié)構(gòu),對(duì)角膜透明性的維持和正常生理功能的發(fā)揮具有重要的作用。嚴(yán)重的眼表疾病可損傷角膜緣區(qū),導(dǎo)致LSCs的缺失及屏障結(jié)構(gòu)的破壞,從而引起一系列眼表反應(yīng),甚至導(dǎo)致失明。目前,LSCs移植是主要的治療方法。但LSCs供體的匱乏使其應(yīng)用受到限制。組織工程角膜緣移植物有望為這一問(wèn)題的解決提供新的思路,其是將體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種于支架材料上所構(gòu)建的與天然角膜緣植片結(jié)構(gòu)和功能較為相似的組織替代物。充足的種子細(xì)胞和適宜的支架材料是組織工程角膜緣移植物構(gòu)建的兩大關(guān)鍵。 角膜上皮暴露于眼表易于受損,理想的LSCs替代來(lái)源應(yīng)有較強(qiáng)的自我更新能力。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)因其所具有的強(qiáng)大增殖能力和分化全能性可作為一種良好的種子細(xì)胞來(lái)源,為組織工程植物物提供無(wú)限的細(xì)胞供給。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外ESCs定向誘導(dǎo)在眼表研究方面多關(guān)注于終末角膜上皮細(xì)胞的分化,但角膜上皮細(xì)胞的增殖分化潛能有限。因此如能將ESCs在體外分化為增殖能力更強(qiáng)的LSCs樣細(xì)胞,可為組織工程角膜緣移植物的構(gòu)建提供更為理想的種子細(xì)胞來(lái)源。 角膜緣區(qū)獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)及基底膜成分是LSCs特性維持的重要基礎(chǔ)。人角膜緣基質(zhì)是構(gòu)建組織工程角膜緣植片的最佳支架材料,但同樣受到供體來(lái)源匱乏的限制。近年來(lái),天然生物材料因其與正常組織近似的結(jié)構(gòu)特性及成分構(gòu)成,成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)：0.5%十二烷基磺酸(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)脫細(xì)胞法可完全脫除豬角膜中的細(xì)胞成分,并保存角膜基質(zhì)正常的膠原排列與基底膜結(jié)構(gòu)。脫細(xì)胞豬角膜緣基質(zhì)(acellular porcine limbal matrix, APLM)保留了角膜緣基質(zhì)特有的三維結(jié)構(gòu),可用于角膜緣基質(zhì)缺損的修補(bǔ)。但APLM能否作為良好的LSCs體外擴(kuò)增載體及移植負(fù)載材料仍需進(jìn)一步的研究。 因此,本研究首先探討了將人ESCs定向誘導(dǎo)分化為L(zhǎng)SCs樣細(xì)胞的可行性,并篩選優(yōu)化了誘導(dǎo)方案,誘導(dǎo)細(xì)胞具有與人LSCs相似的形態(tài)及表型,增殖能力良好,可進(jìn)一步分化為角膜上皮細(xì)胞樣細(xì)胞；其次通過(guò)分析APLM基底膜成分,證實(shí)APLM可支持人LSCs的粘附生長(zhǎng)及干細(xì)胞特性的維持,可作為良好的LSCs體外擴(kuò)增載體及移植負(fù)載材料；最后,我們利用人ESCs來(lái)源LSCs樣細(xì)胞聯(lián)合APLM構(gòu)建了組織工程LSCs移植物,并進(jìn)行了初步的動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示構(gòu)建物在重建角膜緣結(jié)構(gòu)及修復(fù)損傷眼表方面具有一定的作用。 第一部分人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜緣干細(xì)胞樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [目的]探討體外誘導(dǎo)人ESCs定向分化為L(zhǎng)SCs樣細(xì)胞的可行性并篩選優(yōu)化誘導(dǎo)方案。 [方法] 1.人ESCs的培養(yǎng)及鑒定：將絲裂霉素C處理過(guò)的胚鼠成纖維細(xì)胞按5×104細(xì)胞/cm2密度接種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)備用。于解剖顯微鏡下將人ESCs克隆團(tuán)分割成小塊,按100個(gè)克隆團(tuán)／皿接種于胚鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上,常規(guī)培養(yǎng)；每6天機(jī)械法傳代。利用免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)人ESCs標(biāo)記物OCT-4和SSEA-3的表達(dá)。 2.人LSCs的原代培養(yǎng)及鑒定：將絲裂霉素C處理過(guò)的3T3鼠成纖維細(xì)胞按2.4×104細(xì)胞/cm2密度接種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)備用。無(wú)菌條件下去除人角膜緣環(huán)殘余結(jié)膜和葡萄膜組織,撕去角膜內(nèi)皮。將剩余組織塊置于2.4U/mldispaseⅡ內(nèi)37℃消化1.5小時(shí),刮取角膜緣上皮,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分鐘,使用DMEM/F12配制的LSCs培養(yǎng)基(DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基)或MCDB151配制的LSCs培養(yǎng)基(MCDB151-LSCs培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞,按5×103細(xì)胞/cm2密度接種于3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞上,常規(guī)培養(yǎng),隔日給予新鮮的DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基或MCDB151-LSCs培養(yǎng)基。利用免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)人LSCs標(biāo)記物p63α、ABCG-2和角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK12的表達(dá)。 3.條件培養(yǎng)基的配制：待LSCs克隆團(tuán)邊緣開(kāi)始融合時(shí),按200μL/cm2分別加入新鮮DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基或MCDB151-LSCs培養(yǎng)基,每24小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,連續(xù)5天,將收集好的上清液用0.22μm濾器過(guò)濾后-80℃保存?zhèn)溆谩⑹占呐囵B(yǎng)基上清液與同種新鮮LSCs培養(yǎng)基分別按照3：1,1：1和1：3的比例混合配制成上清液濃度分別為75%,50%和25%的DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基或MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基,4℃保存?zhèn)溆�。收集單�?dú)培養(yǎng)3T3細(xì)胞的DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基上清液與MCDB151-LSCs培養(yǎng)基上清液與同種新鮮LSCs培養(yǎng)基按照1：1比例混合配制成DMEM/F12-3T3條件培養(yǎng)基及MCDB151-3T3條件培養(yǎng)基,作為對(duì)照使用。 4.人ESCs的定向誘導(dǎo)及標(biāo)記物的鑒定：機(jī)械法分割人ESCs克隆團(tuán),移入35mmm低粘附細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)采用擬胚體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)5天,即獲得球形的擬胚體。將擬胚體接種于預(yù)包被Ⅳ性膠原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi),分別給予配置好的不同濃度的條件培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)12天。根據(jù)所加入條件培養(yǎng)基的種類(lèi)及濃度不同,分別將誘導(dǎo)細(xì)胞命名為75%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基組(75DF),50%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基組(50DF),25%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基組(25DF),75%MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組(75M),50%MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組(50M),25%MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組(25M),及DMEM/F12-3T3條件培養(yǎng)基組(DF-3T3)、MCDB151-3T3條件培養(yǎng)基組(M-3T3)。利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)各組誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p63α、ABCG-2及CK12的表達(dá),篩選優(yōu)化誘導(dǎo)方案。 5、誘導(dǎo)細(xì)胞克隆形成能力及分化水平的檢測(cè)：將誘導(dǎo)細(xì)胞接種于3T3飼養(yǎng)層上,每隔10天進(jìn)行傳代,直至鏡下觀察無(wú)明顯克隆團(tuán)形成為止。利用Giemsa染色法檢測(cè)不同代間誘導(dǎo)細(xì)胞的克隆形成能力。利用免疫細(xì)胞熒光比較不同代間誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p63α、ABCG-2及CK12的表達(dá)情況。 [結(jié)果] 人ESCs與原代人LSCs均可在飼養(yǎng)層上形成克隆團(tuán)樣結(jié)構(gòu),并表達(dá)各自特征性的細(xì)胞標(biāo)記物。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：更換條件培養(yǎng)基24小時(shí)后,擬胚體即貼壁生長(zhǎng)。75DF組內(nèi)細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅紊掀蛹?xì)胞,大小形態(tài)均一,呈鋪路石樣,9天后局部可見(jiàn)復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組自第9天起克隆團(tuán)邊緣出現(xiàn)類(lèi)神經(jīng)樣細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)差異,差異性隨條件培養(yǎng)基濃度降低而增高。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果表明誘導(dǎo)細(xì)胞于第9天出現(xiàn)ABCG-2、p63α表達(dá)高峰,其中75DF組表達(dá)量明顯高于其余各組；誘導(dǎo)前9天CK12表達(dá)量維持較低水平,12天時(shí)開(kāi)始升高。免疫細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)顯示75%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率最高,培養(yǎng)9天時(shí),約80%的誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)ABCG-2,超過(guò)40%的細(xì)胞呈p63α陽(yáng)性。體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)細(xì)胞可連續(xù)傳代4代以上。隨傳代次數(shù)增加,細(xì)胞內(nèi)CK12表達(dá)上調(diào),呈角膜上皮細(xì)胞表型。 [結(jié)論] 通過(guò)條件培養(yǎng)基體外模擬角膜緣微環(huán)境,可將人ESCs誘導(dǎo)分化為L(zhǎng)SCs樣細(xì)胞。 第二部分脫細(xì)胞豬角膜緣基質(zhì)的制備及生物學(xué)特性檢測(cè) [目的] 探討APLM作為人LSCs體外擴(kuò)增載體及移植負(fù)載材料的可行性。 [方法] 1. APLM及APCM的制備：無(wú)菌條件下切取新鮮豬角鞏膜緣(含1mm鞏膜,2mm外周角膜)及中央角膜(直徑7.5mm)組織,置于0.5%SDS溶液中4℃脫細(xì)胞24小時(shí)。無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)漂洗脫細(xì)胞組織16小時(shí),去除SDS。切取含前彈力層的脫細(xì)胞角鞏膜緣基質(zhì)及脫細(xì)胞角膜基質(zhì)(厚約0.5mm),即獲得APLM與APCM支架。 2.脫細(xì)胞羊膜(denuded amniotic membrane, DAM)的制備：無(wú)菌條件下將新鮮羊膜修剪成5cm×5cm的小塊,上皮面朝上平鋪于無(wú)菌乙酸纖維素薄膜,置于1：1的甘油-DMEM溶液中-144℃冰箱保存。使用前于室溫解凍水化30分鐘,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA37℃消化1h后,小心刮除羊膜上皮細(xì)胞,根據(jù)需要修剪大小,即為DAM支架。 3.支架材料的形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)：HE染色及DAPI染色檢測(cè)APLM、APCM及DAM支架材料中細(xì)胞脫除情況。采用免疫組織熒光方法分析比較APLM、 APCM、DAM及正常人角膜緣基底膜中collagen Ⅳ a2, laminin β1, perlecan, agrin, laminin a2, lamininγ3, tenascin-C的表達(dá)情況。 4.組織工程LSCs植片的構(gòu)建及其形態(tài)功能的檢測(cè)：將APLM、APCM及DAM置于DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基內(nèi)37℃浸泡24小時(shí),基底膜面向上置于24孔板內(nèi)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人LSCs消化離心制成細(xì)胞懸液,按細(xì)胞密度1.5×103細(xì)胞/mm2接種于APLM、APCM及DAM表面,待細(xì)胞貼壁后補(bǔ)足培養(yǎng)基至支架表面被浸沒(méi)。常規(guī)培養(yǎng)21天后,通過(guò)HE染色檢測(cè)組織形態(tài),利用免疫組織熒光檢測(cè)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)接種細(xì)胞內(nèi)ABCG-2、p63α及CK12的表達(dá)。 [結(jié)果] HE染色及DAPI染色顯示APLM、APCM及DAM支架中未見(jiàn)細(xì)胞成分殘留,材料內(nèi)膠原排列及基底膜結(jié)構(gòu)保留完好。免疫組織熒光檢測(cè)表明人角膜緣組織、APLM及DAM基底膜均高表達(dá)collagen Ⅳα2、laminin β1、perlecan及agrin;APCM基底膜中可見(jiàn)perlecan高表達(dá),collagen IV a2和lamininβ1微弱表達(dá),未觀察到agrin表達(dá)。人角膜緣區(qū)基底膜特異性標(biāo)記物laminin α2、laminin γ3和tenascin-C在APLM基底膜均高表達(dá)；APCM和DAM內(nèi)未觀察到三者的表達(dá)。接種LSCs在APLM、APCM及DAM表面均可形成排列緊密的復(fù)層上皮細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。APLM上可見(jiàn)4-5層細(xì)胞-底層細(xì)胞呈矮柱狀,排列緊密,表層細(xì)胞呈扁平狀,與正常角膜緣細(xì)胞結(jié)構(gòu)近似。接種細(xì)胞于APCM上可形成2-3層細(xì)胞,底層未見(jiàn)矮柱狀細(xì)胞。DAM上擴(kuò)增的細(xì)胞達(dá)5-6層,細(xì)胞體積較大,排列緊密,表層為扁平狀細(xì)胞,基底部無(wú)明顯矮柱狀細(xì)胞。免疫組織熒光檢測(cè)證實(shí)APCM及DAM上的細(xì)胞廣泛表達(dá)CK12,但ACBG-2及p63α表達(dá)較弱。APLM上擴(kuò)增的細(xì)胞：基底部細(xì)胞層高表達(dá)ABCG-2及p63α, CK12表達(dá)則多集中于表層細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)顯不APLM接種細(xì)胞內(nèi)p63α、ABCG-2的表達(dá)量約為DAM或APCM接種細(xì)胞的2倍, CK12的表達(dá)量?jī)H為后兩者的40%。 [結(jié)論] APLM基底膜具有與人角膜緣基底膜相似的成分構(gòu)成,可良好支持人LSCs的體外擴(kuò)增及干細(xì)胞特性的維持。 第三部分脫細(xì)胞豬角膜緣基質(zhì)聯(lián)合人胚胎干細(xì)胞來(lái)源角膜緣干-細(xì)胞構(gòu)建角膜緣移植物修復(fù)損傷眼表的初步研究 [目的] 探討人ESCs來(lái)源LSCs樣細(xì)胞聯(lián)合APLM構(gòu)建角膜緣移植物,重建角膜緣微環(huán)境及修復(fù)損傷眼表的可行性。 [方法] 1.組織工程角膜緣移植物的構(gòu)建：采用75%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人ESCs9天,將誘導(dǎo)細(xì)胞按細(xì)胞密度1.5×103細(xì)胞/mm2接種于APLM及DAM表面。常規(guī)培養(yǎng)21天,通過(guò)HE染色檢測(cè)植片組織形態(tài)。 2.組織工程角膜緣移植物的移植實(shí)驗(yàn)：采用角膜緣干細(xì)胞組織切除聯(lián)合角膜上皮化學(xué)燒傷法建立LSCs失代償動(dòng)物模型,即用3%戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)用兔,板層切除角膜緣組織,正-庚醛去除中央角膜上皮,1月后根據(jù)角膜混濁、新生血管及熒光素染色情況對(duì)損傷眼表進(jìn)行評(píng)分,各項(xiàng)評(píng)分≥2者,即為L(zhǎng)SCs失代償。將15只LSCs失代償兔,隨機(jī)分為3組,每組5只。A組：移植人ESCs來(lái)源LSCs聯(lián)合APLM構(gòu)建的組織工程植片；B組：移植人ESCs來(lái)源LSCs聯(lián)合DAM構(gòu)建的組織工程植片；C組：移植APLM支架材料。術(shù)后每日給予典必殊眼水3次,典必殊眼膏1次,定期裂隙燈下觀察眼表修復(fù)情況,1月后行病理檢查。 [結(jié)果] 誘導(dǎo)細(xì)胞可于APLM及DAM表面形成4-5層細(xì)胞,細(xì)胞排列緊密,APLM復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)中底層細(xì)胞呈矮柱狀,表層細(xì)胞則呈扁平狀。移植術(shù)后1周,各組球結(jié)膜充血明顯,角膜混濁水腫。術(shù)后2周,A、B組炎癥反應(yīng)減輕,角膜水腫有所消退,B組可見(jiàn)羊膜降解；C組角膜仍明顯水腫。移植術(shù)后1個(gè)月,A組角膜透明度明顯改善,熒光素染色陰性,僅角膜緣區(qū)可見(jiàn)少量新生血管；B組角膜透明度有所改善,熒光素染色陰性,可見(jiàn)少量新生血管長(zhǎng)入；C組角膜新生血管及角膜混濁明顯,角膜結(jié)膜化,熒光素染色陽(yáng)性。HE染色顯示A組角膜上皮結(jié)構(gòu)完整；B組上皮結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)部分空泡狀杯狀細(xì)胞；C組則未見(jiàn)連續(xù)角膜上皮結(jié)構(gòu)。 [結(jié)論] 人ESCs來(lái)源LSCs樣細(xì)胞聯(lián)合APLM構(gòu)建的角膜緣移植物在重建角膜緣結(jié)構(gòu)及修復(fù)損傷眼表方面具有一定的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R779.65

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本文編號(hào)：2316641