【摘要】：第一章大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型研究 目的：建立大鼠急性高眼壓視網(wǎng)膜缺血再灌注(I/R)損傷模型,對該模型中急性眼壓升高、缺血及再灌注等因素對視網(wǎng)膜組織形態(tài)學改變、視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞凋亡以及視網(wǎng)膜功能學的影響進行研究,對該模型造成視網(wǎng)膜損傷過程中的特點進行探討,進一步對其作為視網(wǎng)膜神經(jīng)保護研究動物模型進行評價。 方法：8周齡SD大鼠,42只,建立急性高眼壓視網(wǎng)膜缺血再灌注模型,21只雙眼造模,12只單眼造模,9只正常對照。雙眼模型術(shù)后1、3、7天檢測大鼠視網(wǎng)膜電圖(ERG)及視覺誘發(fā)電位(VEP)改變,視網(wǎng)膜鋪片Nissl染色及DiI熒光染料上丘逆行標記觀察RGC數(shù)目,視網(wǎng)膜切片行HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學變化,TUNEL染色檢測視網(wǎng)膜組織細胞凋亡情況。單眼模型組術(shù)后7天檢測VEP、ERG、RGC數(shù)目及視網(wǎng)膜組織形態(tài)學改變。 結(jié)果：正常大鼠視網(wǎng)膜厚度為180.8±3.33um,內(nèi)叢狀層(IPL)厚度為48.71±1.05um。I/R損傷后1天網(wǎng)膜全層厚度無明顯改變(172.9±4.71um),IPL厚度變薄(43.58±1.88um,p0.05vs對照組),損傷3天后視網(wǎng)膜厚度為142.3±3.55um(p0.01vs.對照組),IPL厚度為28.23±0.64um (p0.01vs.對照組),損傷7天后視網(wǎng)膜厚度為124.8±2.13um (p0.01vs對照組),IPL厚度為13.56±0.52um(p0.01vs.對照組)。I/R損傷3天后RGC數(shù)目明顯減少,Nissl染色RGC數(shù)目約為對照組88.86%(p0.05),損傷7天后進一步減少至57.18%(p0.01)。上丘逆行標記法損傷7天后標記RGC數(shù)目約為對照組46%(p0.01vs.對照)。損傷1天后大鼠ERG各成分振幅均顯著下降(a、b p0.01vs對照),損傷7天后a波振幅降低約53%,b波振幅下降達到71%(p0.01vs.對照)；VEP各成分波損傷后1天振幅均顯著下降(N1P1、P1N2、N2P2與對照組之間p0.01),隨時間推移損傷持續(xù)加重。損傷1天后,視網(wǎng)膜組織可見大量TUNEL標記細胞,包括RGC、INL、ONL層,損傷3天后僅見少量TUNEL陽性細胞,7天后網(wǎng)膜中幾乎無TUNEL標記細胞。單眼模型在視網(wǎng)膜組織形態(tài)學及功能學損傷與雙眼模型無統(tǒng)計學差異,損傷對側(cè)眼與正常對照無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：急性高眼壓引起的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型,可造成大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學及視功能損傷。該模型早期可誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡,是研究視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷的理想模型。損傷后進行RGC上丘逆行標記可間接反應(yīng)RGC存活及功能狀況。單眼造模損傷后,對側(cè)眼形態(tài)學及功能學無損傷性改變,可作獨立作為藥物干預的對照。 第二章PPAR-γ配體匹格列酮對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護作用 目的：本研究采用PPAR-γ化學合成配體匹格列酮經(jīng)不同給藥途徑對大鼠急性高眼壓視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型進行預處理,探索PPAR-γ配體對視網(wǎng)膜損傷過程中可能存在的保護作用。 方法：8周齡SD大鼠,80只,隨機分為I/R組、匹格列酮1.0mg/kg腹腔注射、匹格列酮0.125mmg球旁注射及正常對照組,每組20只,取右眼為實驗眼。I/R損傷前3小時匹格列酮給藥組進行預處理。術(shù)后24小時視網(wǎng)膜組織切片行TUNEL染色檢測視網(wǎng)膜組織細胞凋亡情況,損傷后7天進行RGC計數(shù)、視網(wǎng)膜切片行HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學變化、檢測大鼠視網(wǎng)膜電圖(ERG)及視覺誘發(fā)電位(VEP)評估視功能。 結(jié)果：大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷后7天,視網(wǎng)膜組織各層厚度顯著下降,(I/R組視網(wǎng)膜厚度119.3±3.593um,p0.05vs. Control;內(nèi)叢狀層(IPL)厚度：13.45±0.476um,p0.01vs. Control)。匹格列酮給藥組均顯著減輕視網(wǎng)膜萎縮變薄,腹腔注射組視網(wǎng)膜厚度為143.7±7.967um(p0.01vs. I/R), IPL厚度：25.54±2.018um(p0.01vs. I/R);球旁給藥組視網(wǎng)膜厚度為158.2+5.848um (p0.01vs. I/R), IPL厚度：34.84±1.429um(p0.01vs. I/R)。球旁給藥組較腹腔給藥組IPL厚度增加(p0.05)。I/R損傷7天后,存活RGC約為1141.14±82.89/mm2(p0.01vs. Control)。匹格列酮腹腔給藥組RGC存活數(shù)目為1890.53±68.96/mm2(p0.01vs. I/R);球旁給藥組為1954.43±38.16/mm2(p0.01vs. I/R)。匹格列酮給藥組損傷后ERG a、b波振幅、VEPN1-P1、P1-N2. N2-P2均較I/R損傷組均顯著增加(p0.01vs. I/R)且球旁給藥組N1-P1及N2-P2振幅高于腹腔給藥組(p0.01in N1-P1; P0.05in N2P2)。I/R損傷后24小時視網(wǎng)膜組織中TUNEL標記細胞數(shù)目為13.85±1.67cells/field (p0.01vs. Control),匹格列酮腹腔給藥組為6.2±0.51cell/field (p0.01vs. I/R),球旁給藥組為8±0.58cell/field (p0.01vs. I/R)。兩種不同方式給藥組之間TUNEL標記細胞數(shù)目無顯著統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：匹格列酮預處理后能夠有效地保護I/R所造成的視網(wǎng)膜組織形態(tài)學損害,改善功能學損傷并且增加有功能的RGC存活率,抑制視網(wǎng)膜組織神經(jīng)元的凋亡,且眼球旁局部給藥效果優(yōu)于全身給藥。 第三章匹格列酮對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷保護機制研究 目的：基于匹格列酮對大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷后視網(wǎng)膜形態(tài)學及功能學的保護作用,對其保護機制做進一步探索。 方法：8周齡SD大鼠,96只,隨機分為I/R組、匹格列酮1.0mg/kg腹腔注射、匹格列酮0.125mg球旁注射及正常對照組,每組24只,取右眼為實驗眼,I/R損傷前3小時匹格列酮給藥組進行預處理。損傷后24小時Western Blot檢測視網(wǎng)膜組織凋亡Bax、Bcl-2、Phospho-ERK(1/2)、ERK(1/2)及PPAR-y表達,損傷后24小時及7天Western Blot、Realtime PCR、免疫組織化學法檢測視網(wǎng)膜組織中活性GFAP表達、TNF-a表達及NF-kB P65激活。 結(jié)果：大鼠I/R損傷后24小時視網(wǎng)膜組織中Bax/Bcl-2水平顯著增高,ERK(1/2)磷酸化水平上調(diào),PPAR-y表達水平較正常大鼠下調(diào)(p0.01),匹格列酮給藥組Bax/Bcl-2比值較I/R損傷組顯著降低(p0.01),球旁給藥組Bax/Bcl-2低于腹腔給藥組(p0.01)。p-ERK/ERK水平顯著低于I/R損傷組(p0.01)；PPAR-γ表達水平顯著上調(diào)(p0.01vs. I/R; p0.01vs. Control)。I/R損傷后24小時,視網(wǎng)膜組織表層部分區(qū)域Muller細胞終足GFAP染色陽性。損傷7天后,GFAP活性區(qū)域貫穿整個網(wǎng)膜且網(wǎng)膜組織中GFAP蛋白表達顯著上調(diào)。匹格列酮給藥組大鼠視網(wǎng)膜組織活性GFAP免疫染色區(qū)域顯著減少且GFAP蛋白表達較損傷組下調(diào)(p0.01vs.I/R), GFAP mRNA水平表達趨勢與蛋白水平一致。I/R損傷后24小時視網(wǎng)膜組織見NF-kBP65核染色陽性細胞,各實驗組NF-kBP65表達無顯著統(tǒng)計學差異。損傷7天后NF-kBP65核染色陽性細胞增加,伴TNF-a表達上調(diào)。匹格列酮預給藥組NF-kBP65核染色陽性細胞較損傷組均顯著減少(p0.01vs.I/R),NF-kB P65蛋白表達水平較I/R損傷組顯著下調(diào)(p0.01),磷酸化水平明顯低于I/R損傷組(p0.01),且TNF-(?)表達亦明顯下調(diào)(p0.01)。不同方式給藥組之間(/)F-kB P65、TNF-a表達無顯著統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷過程中匹格列酮通上調(diào)Bcl-2而發(fā)揮抗凋亡作用,可抑制I/R引起的膠質(zhì)細胞激活,并通過對NF-κB信號通路的調(diào)控抑制損傷后炎癥反應(yīng)的激活。MAPK信號通路也涉及其中。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1

【共引文獻】

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本文編號：2307421