【摘要】： 腫瘤DNA損傷修復(fù)是放療失敗的主要原因。電離輻射造成細(xì)胞DNA損傷類型包括脫氧核糖變化、堿基變化、DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂、形成DNA-DNA交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等,其中DNA雙鏈損傷(double-stranded breaks, DSBs)是最嚴(yán)重的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞失去分裂增生能力而死亡,是電離輻射致腫瘤細(xì)胞死亡主要機(jī)制。DNA雙鏈損傷修復(fù)在正常細(xì)胞中,可增強(qiáng)放療靶區(qū)中正常組織的耐輻射能力,但在腫瘤細(xì)胞中,可能導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。修復(fù)機(jī)制包括同源重組修復(fù)(homologous recombination repair, HRR)和非同源末端連(nonhomologous end joining, NHEJ)。研究表明MRE11-RAD50-NBS1復(fù)合物在DSBs修復(fù)中發(fā)揮重要作用。其中MRE11的N端具有4個(gè)保守的磷酸酯酶區(qū)域,C端有2個(gè)DNA結(jié)合區(qū),并具有單鏈／雙鏈核酸內(nèi)切酶的活性和3′→5′核酸外切酶活性,能識(shí)別并結(jié)合到DSBs處,與RAD50、NBS1相互作用共同完成修復(fù)。研究X射線照射后腫瘤細(xì)胞中MRE11基因及其蛋白表達(dá)的規(guī)律,并探討其與腫瘤放療失敗的相關(guān)性,為提高腫瘤放射治療療效開辟新途徑,提供新的靶點(diǎn)。 目的：鼻咽癌細(xì)胞株CNE1經(jīng)2Gy、4Gy、6Gy、8Gy不同劑量X線照射后4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)各組MRE11mRNA表達(dá)與未照射組比較,觀察射線照射對(duì)MRE11mRNA的表達(dá)變化。CNE1細(xì)胞株經(jīng)4GyX線照射1.5h、4h、6h、8h、12h、24h后MRE11蛋白的表達(dá)變化。從基因和蛋白水平探討了鼻咽癌細(xì)胞株CNE 1經(jīng)照射后MRE 11基因及其蛋白的表達(dá)改變。 方法：選取人鼻咽癌CNE 1細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)及X線照射。按單次照射0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy劑量分組,照射后4小時(shí)收集,利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MRE11mRNA的表達(dá);CNE 1細(xì)胞株單次照射4Gy于第0h、1.5h、4h、6h、8h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)收集固定,利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MRE11蛋白的表達(dá),并采用Image-Pro Plus 5.0軟件分析測(cè)定各組熒光的平均光密度值(mOD)。 結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)CNE 1細(xì)胞株分別經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8GyX線照射后4小時(shí)MRE11mRNA半定量灰度值分別為1.1±0.43,0.87±0.42,0.81±0.32,0.87±0.48,0.83±0.21,經(jīng)單因素方差分析(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)),P=0.9797(P0.05),各組之間MRE11mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CNE1細(xì)胞株經(jīng)4GyX線照射后0h、1.5h、4h、6h、8h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)MRE11蛋白的表達(dá),由熒光強(qiáng)度表示和平均光密度(mOD)表示。發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱,4小時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。各組mOD分別138.7±24.91、238.1±19.57、721.5±14.60、326.4±22.74、262.0±27.68、228.6±20.32、132.2±24.73,經(jīng)單因素方差分析(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)),1.5h、4h、6h、8h、12h組與0h組比較,P0.05, MRE11蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;24h組與0h組比較,P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：CNE1細(xì)胞株MRE11mRNA的表達(dá)與X線照射劑量遞增無(wú)相關(guān)性。但CNE1細(xì)胞株經(jīng)X線照射后MRE11蛋白的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增強(qiáng)后減弱,且在照射4小時(shí)表達(dá)最強(qiáng),24小時(shí)后恢復(fù)到未照射水平。
[Abstract]:DNA damage repair is the main reason for the failure of radiotherapy. The types of DNA damage induced by ionizing radiation include deoxyribose changes, base changes, DNA single strand breaks, DNA double strand breaks, DNA-DNA crosslinking and DNA- protein cross-linking, among which DNA double strand damage (double-stranded breaks, DSBs) is the most serious. The main mechanism of tumor cell death caused by ionizing radiation is that the cells lose the ability to divide and proliferate. The repair of DNA double strand damage in normal cells can enhance the radioresistance of normal tissues in the target region of radiotherapy, but in tumor cells, It may lead to local recurrence and metastasis of tumor. Repair mechanisms include homologous recombination repair (homologous recombination repair, HRR) and non-homologous terminal linked (nonhomologous end joining, NHEJ). It has been shown that MRE11-RAD50-NBS1 complex plays an important role in DSBs repair. The N-terminal of MRE11 has four conserved phosphatase regions, and the C-terminal has two DNA binding regions. It has the activity of single-stranded / double-stranded nucleic acid endonuclease and the exonuclease activity of 3'5 'nucleic acid, which can recognize and bind to DSBs. Work with RAD50,NBS1 to complete the repair. To study the expression of MRE11 gene and its protein in tumor cells after X-ray irradiation, and to explore the relationship between the expression of MRE11 gene and the failure of radiotherapy, and to provide a new target for improving the therapeutic effect of radiotherapy. Objective: to observe the changes of MRE11mRNA expression in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE1 at 4 hours after irradiation with different doses of 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy or 8 Gy, and to observe the changes of MRE11mRNA expression in CNE1 cell line irradiated with 4GyX for 1. 5 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h and 24 h after 4GyX irradiation. The expression of MRE 11 gene and its protein in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE 1 after irradiation were studied at gene and protein levels. Methods: human nasopharyngeal carcinoma (NPC) CNE 1 cell line was cultured in vitro and irradiated by X-ray. The expression of MRE11mRNA was detected by RT-PCR technique, and the expression of MRE11 protein was detected by immunofluorescence technique, and the expression of MRE11 protein was detected by immunofluorescence technique, and the expression of MRE11 protein was detected by immunofluorescence technique, and the expression of MRE11 protein was detected by immunofluorescence technique at the time point of 12 h and 12 h after single irradiation of 0 Gy ~ 2 Gy ~ (2) Gy ~ (4) Gy ~ (6) Gy. The average optical density (mOD).) of fluorescence in each group was determined by Image-Pro Plus 5.0 software. Results: the semi-quantitative gray value of CNE 1 cell line was 1.1 鹵0.43 鹵0.82 鹵0.82 鹵0.82 鹵0.87 鹵0.88 鹵0.83 鹵0.21 at 4 hours after 0 Gy ~ 2 Gy ~ 4 Gy ~ 6 Gy ~ (8) Gy X-ray irradiation, respectively. There was no significant difference in the expression of MRE11mRNA between the three groups by Kruskal-Wallis test (P 0.05). Immunofluorescence technique was used to detect the expression of MRE11 protein in CNE1 cell line at 24 h after 4GyX irradiation. The expression of MRE11 protein was expressed by fluorescence intensity and average optical density (mOD). It was found that the fluorescence intensity first increased and then decreased, and the fluorescence intensity was the strongest in 4 hours. MOD in each group was 138.7 鹵24.91238.1 鹵19.57721.5 鹵14.60326.4 鹵22.74262.0 鹵27.68228.6 鹵20.32132.2 鹵24.73.The expression of P0.05 and MRE11 protein was not significantly different between 24 h group and 0 h group by single factor variance analysis (Kruskal-Wallis test). Conclusion: there is no correlation between the expression of MRE11mRNA in CNE1 cell line and the increasing dose of X-ray irradiation. However, the expression of MRE11 protein in CNE1 cells increased first and then decreased with the prolongation of time, and the expression of MRE11 protein was strongest at 4 hours of irradiation, and recovered to the level of no irradiation after 24 hours of irradiation.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2291013