【摘要】： 青光眼是全球最常見的不可逆性致盲眼病之一,青光眼視神經(jīng)病變是該病致盲的根本原因。目前公認的發(fā)生機制是由于眼壓升高造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和其它視網(wǎng)膜細胞發(fā)生以變性壞死為特征的原發(fā)性損害,隨后又通過一系列途徑誘發(fā)以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞持續(xù)性凋亡為特征的繼發(fā)性損害,從而導(dǎo)致視神經(jīng)功能進行性損傷。目前除了應(yīng)用藥物、手術(shù)等手段降低升高的眼內(nèi)壓,控制疾病的原發(fā)性損害以外,尚無有效手段防治視神經(jīng)的繼發(fā)性損害。視神經(jīng)由RGCs的軸索組成,是間腦白質(zhì)的主要成分,視神經(jīng)和視網(wǎng)膜作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)在顱外的延伸,在位置上具有著中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部分不可比似的易操作性,因而視神經(jīng)損傷模型常被用來模擬大腦的軸突損傷；其中視神經(jīng)鉗夾傷模型能夠較好地模擬RGCs繼發(fā)性凋亡,即使視神經(jīng)被完全截斷后,仍有相當(dāng)一部分數(shù)量的RGCs能夠存活一段時間。這種鉗夾傷后的神經(jīng)退行性過程與青光眼視神經(jīng)病變的病理過程相類似。 高壓氧治療已在臨床應(yīng)用多年,具有確切治療效果的疾病包括一氧化碳中毒、中風(fēng)、空氣栓塞及減壓病等。目前大量的研究顯示高壓氧預(yù)處理對大腦缺血缺氧引起的遲發(fā)型損傷有確切的神經(jīng)保護作用,但HBO-PC保護效應(yīng)的確切機制尚未闡明,在臨床應(yīng)用前還需要大量的實驗證據(jù)。目前,人們普遍認為HBO誘導(dǎo)腦神經(jīng)保護作用的機制主要有以下兩個方面：一是HBO預(yù)處理誘導(dǎo)機體組織細胞產(chǎn)生大量的活性氧,進而引起機體的抗氧化酶增多,增強機體抗氧化損傷能力；二是HBO預(yù)處理可誘導(dǎo)腦內(nèi)的抗凋亡蛋白升高,增強機體的抗凋亡損傷能力。 視神經(jīng)鉗夾傷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性變過程和腦損傷所引起的繼發(fā)性神經(jīng)元退變過程相似,因此我們采用一種臨床實際工作中可行而有效的高壓氧預(yù)處理方法,從病理學(xué)、形態(tài)學(xué)、視功能等各個方面驗證這種預(yù)處理方法對視神經(jīng)不完全損傷是否具有保護效應(yīng),并初步探討HBO預(yù)處理發(fā)揮視神經(jīng)保護作用的分子機制。 第一部分大鼠不完全視神經(jīng)損傷模型的建立及高壓氧預(yù)處理對視神經(jīng)不完全損傷的保護效應(yīng)目的：建立穩(wěn)定的大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型,研究高壓氧預(yù)處理對大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護效應(yīng)。 方法：采用2.5 ATA,100%O2,每天2次,連續(xù)2天的高壓氧預(yù)處理方法,末次處理后次日采用Yasargil動脈瘤夾制作大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型。動物分為Sham組、ONC組,HBO+ONC組。分別在建模后1周或2周采用HE染色、熒光金逆行標(biāo)記、閃光視覺誘發(fā)電位及TUNEL觀察或檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的形態(tài)、數(shù)量和視神經(jīng)功能的改變。 結(jié)果：建模1周時Sham組視網(wǎng)膜節(jié)細胞層中HE著色的細胞數(shù)量為89.5±9.4個/高倍視野,2周時為92.7±9.1個／高倍視野；而1周和2周時HBO+ONC組的視網(wǎng)膜節(jié)細胞層中HE著色的細胞數(shù)量顯著較ONC組多(69.3±7.4 vs 56.6±6.5個／高倍視野,1w,P0.01；62.3±6.1 vs 46.1±6.6,2w,P0.01)。建模2周時熒光金逆行標(biāo)記顯示,Sham組的存活視網(wǎng)膜節(jié)細胞的平均密度為1650±216/mm2,而HBO+ONC組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞平均密度顯著高于Sham組(995±158/mm2和478±101/mm2,P0.01)。閃光視覺誘發(fā)電位結(jié)果顯示,相對于HBO+ONC組,ONC組P1波的潛伏期延長、振幅降低。視神經(jīng)鉗夾傷后1周時Sham組、HBO+ONC組和ONC組P1波的潛伏期和振幅分別為90±4ms、94±4ms、108±6ms(P0.05,HBO+ONC vs ONC)；17±2μv、18±3μv和12±2μv(P0.01,HBO+ONC vs ONC)。2周時Sham組、HBO+ONC組和ONC組P1波的潛伏期和振幅分別為92±7ms、117±12ms、169±15ms(P0.01,HBO+ONC vs ONC)；21±3μv、14±2μv和7±1μv(P0.01,HBO+ONCvs ONC)。 結(jié)論：HBO預(yù)處理能使視神經(jīng)損傷后的視網(wǎng)膜節(jié)細胞存活率顯著提高,同時改善視神經(jīng)的功能狀態(tài),確認HBO預(yù)處理對大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護效應(yīng)。 第二部分 高壓氧預(yù)處理抑制線粒體途徑的凋亡誘導(dǎo)對大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護效應(yīng) 目的：研究高壓氧預(yù)處理對線粒體凋亡途徑的影響。 方法：按第一部分方法進行高壓氧預(yù)處理和建模。使用TUNEL法檢測RGCs凋亡數(shù)量；ELISA法檢測視網(wǎng)膜caspase-3和caspase-9的酶活性；Western Blot檢測cytochrome c、Bcl-2 BclxL、和Bax蛋白表達量。 結(jié)果：HBO預(yù)處理能明顯減少視神經(jīng)不完全損傷后RGCs的凋亡陽性細胞數(shù)(ONC：19.1±4.2/HPF vs.HBO+ONC：7.2±1.3/HPF,P0.01),ONC組視網(wǎng)膜組織的caspase-3和caspase-9酶相對活性顯著高于HBO+ONC組(P0.05)。HBO預(yù)處理顯著減少了視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜組織胞漿cytochromec的蛋白水平(P0.05),同時提高了抗凋亡蛋白Bcl-2、BclxL的水平(P0.01,P0.05),但對促凋亡蛋白Bax的表達影響不明顯(P0.05)。 結(jié)論：高壓氧預(yù)處理可能通過抑制線粒體途徑的凋亡發(fā)揮對視神經(jīng)不完全損傷的保護效應(yīng)。 第三部分 高壓氧預(yù)處理調(diào)控HIF/EPO通路誘導(dǎo)對大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護效應(yīng) 目的：研究HBO預(yù)處理的保護效應(yīng)是否與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1及下游神經(jīng)保護性基因EPO的表達有關(guān)。 方法：按第一部分方法進行高壓氧預(yù)處理,末次處理后次日直接取材。動物分為對照組和HBO預(yù)處理組。使用RT-PCR方法和Western Blot檢測HBO預(yù)處理對視網(wǎng)膜組織HIF-1及其下游基因EPO的mRNA表達和蛋白含量的影響,并檢測EPO下游信號分子P-Akt和HSP-27蛋白表達的影響。 結(jié)果：HBO預(yù)處理能顯著上調(diào)大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1和EPO mRNA的表達,分別是對照組的13.38±1.97倍和5.55±1.03倍(P0.01)；同時HIF-1α和EPO蛋白表達顯著增加,分別是對照組的1.86±0.24倍和3.01±0.33倍(P0.01)。HBO預(yù)處理組視網(wǎng)膜組織中P-Akt和HSP-27蛋白表達也顯著增加,分別是對照組的1.64±0.11倍和1.81±0.12倍(P0.01)。 結(jié)論：HBO預(yù)處理誘導(dǎo)增強視網(wǎng)膜組織中HIF-1和下游神經(jīng)保護性基因EPO的表達,可能是其發(fā)揮視神經(jīng)不完全損傷保護效應(yīng)的機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R774.6

【參考文獻】

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本文編號：2287488