發(fā)布時間：2018-10-21 16:58

【摘要】：喉癌作為呼吸道第二高發(fā)癌，其發(fā)病率逐年上升。目前，喉鱗狀細(xì)胞癌的主要治療手段大體上可分為手術(shù)、放療、化療三大類，化療作為喉鱗狀細(xì)胞癌及其他頭頸癌的主要治療手段，往往存在化療不敏感、化療抵抗以及化療后易復(fù)發(fā)等。因此，增強喉癌化療敏感性，降低化療的抵抗作用，就成為了廣大學(xué)者爭相追逐的研究熱點之一。 諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，化療時喉癌細(xì)胞易產(chǎn)生多藥耐藥,使得腫瘤對化療藥物敏感性降低、抵抗作用增強。人們還發(fā)現(xiàn)了另一種可以解釋腫瘤化療不敏感的思路--“腫瘤干細(xì)胞理論”：腫瘤對化療產(chǎn)生抵抗可能是通過腫瘤干細(xì)胞實現(xiàn)的，化療可以殺滅大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，對腫瘤干細(xì)胞卻沒有作用，腫瘤干細(xì)胞經(jīng)過增殖，最終又可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性、逆轉(zhuǎn)干腫瘤細(xì)胞的化療抵抗，已成為當(dāng)前提高腫瘤化療效果的關(guān)鍵所在。 姜黃素(curcumin)是一種黃色結(jié)晶粉末狀植物多酚，源自姜黃(Curcuma longa Linn)根莖，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗腫瘤、抗突變等作用，尤其對CSC有特異的抑制作用。先前的研究證實，姜黃素對前列腺癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞、胃腺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞及人肝癌細(xì)胞等有明顯抑制作用，對喉癌細(xì)胞的作用卻鮮有報道，另外，此類作用的相關(guān)機制也不十分清楚。因此，我們的研究將探討姜黃素對喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討姜黃素和順鉑對喉癌細(xì)胞的“抗腫瘤”作用，分析姜黃素增強喉癌細(xì)胞化療敏感性的作用機制。為姜黃素在喉癌化療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，同時也為姜黃素對腫瘤干細(xì)胞的特異性殺傷作用提供理論支持，為最終提高臨床喉癌的化療效果尋找新的途徑。 研究方法： 為了探討姜黃素對喉癌的增敏作用，我們的實驗分為體外、體內(nèi)兩部分，采取以下實驗方法： 體外實驗部分： 1.集落形成實驗、MTT實驗--姜黃素聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的影響 2.Annexin-V/PI雙標(biāo)實驗--姜黃素聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的影響 3.細(xì)胞劃痕實驗--姜黃素聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細(xì)胞體外遷移能力的影響 4.流式細(xì)胞儀檢測和流式細(xì)胞儀CD133+細(xì)胞分選實驗--姜黃素與順鉑對Hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞群的影響 5.Western-blot實驗--姜黃對CD133+細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)的影響 體內(nèi)實驗部分： 1.腫瘤生長測定 2.腫瘤終末體積測量 3. Tunel法--姜黃素和順鉑對腫瘤細(xì)胞凋亡的作用 4. western-blot法--檢測腫瘤凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 結(jié)果： 體外實驗部分： 1.集落形成實驗表明，聯(lián)合應(yīng)用順鉑和姜黃素可以減少Hep-2細(xì)胞的增殖，抑制集落形成，未處理組克隆集落（大于100個細(xì)胞）數(shù)為526±35個，姜黃素組和順鉑組形成的集落數(shù)都減少，而姜黃素聯(lián)合順鉑組的集落數(shù)明顯減少到150±40個，而且集落的大小也明顯變小， P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；單純姜黃素和姜黃素脂質(zhì)體組則無明顯差異，由此也證實脂質(zhì)體可作為姜黃素的載體，而對喉癌Hep-2細(xì)胞不起到明顯生物學(xué)作用。 2. MTT實驗進(jìn)一步證實聯(lián)合應(yīng)用姜黃素和順鉑可顯著抑制Hep-2細(xì)胞的增殖，單獨應(yīng)用順鉑，增殖能力減少約60%，而在姜黃素聯(lián)合順鉑給藥組，增殖能力減少約90%，P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣，該實驗也證明了脂質(zhì)體可以作為安全的載體，對Hep-2細(xì)胞沒有作用。 3. Annexin V/PE雙標(biāo)法實驗證實，姜黃素和順鉑分別單獨對Hep-2細(xì)胞作用48小時，都可以促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的凋亡，當(dāng)姜黃素與順鉑聯(lián)合應(yīng)用時，，這種促進(jìn)凋亡的作用就更加顯著。未處理組Hep-2細(xì)胞凋亡百分比為2.35±1.6%，姜黃素和順鉑單獨處理組Hep-2細(xì)胞凋亡百分比增加到13.4±2.8%和32.1±9.5%，而姜黃素+順鉑聯(lián)合給藥組Hep-2細(xì)胞凋亡百分比則明顯上升，為54.4±11.8%。 4.劃痕實驗檢測姜黃素和順鉑對喉癌Hep-2細(xì)胞體外遷移能力的影響：姜黃素組、順鉑組及姜黃素+順鉑組的Hep-2細(xì)胞較空白對照組細(xì)胞遷移距離縮短，并且聯(lián)合給藥組Hep-2細(xì)胞遷移距離縮短更加明顯，這說明姜黃素聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細(xì)胞體外遷移能力有明顯的抑制作用。 5.流式細(xì)胞儀檢測和流式細(xì)胞儀CD133+細(xì)胞分選實驗檢測：未處理組Hep-2細(xì)胞中，CD133+細(xì)胞群平均檢出率為4.5±1.2%，順鉑組Hep-2細(xì)胞中，CD133+細(xì)胞群檢出率為6.89±1.1%，但順鉑聯(lián)合姜黃素聯(lián)合給藥組Hep-2細(xì)胞中，CD133+細(xì)胞群檢出率明顯減少，為1.49±1.0%。順鉑組相較順鉑+姜黃素聯(lián)合給藥組的峰值曲線有明顯的左移，這個結(jié)果表明，化療藥順鉑可以使CD133+富集，而當(dāng)順鉑聯(lián)合姜黃素應(yīng)用時，這種富集作用被明顯的抑制了。 6.利用western blot法檢測ABCG2蛋白表達(dá)，在CD133+細(xì)胞群中，ABCG2在未處理組CD133+中高表達(dá)，在姜黃素+順鉑聯(lián)合給藥組低表達(dá)；在CD133-細(xì)胞群中，ABCG2也呈低表達(dá)，β-action作為對照。可見，分組處理后，CD133+和CD133-細(xì)胞被收集并檢測ABCG2蛋白表達(dá)，未處理組和順鉑處理組CD133+細(xì)胞中ABCG2表達(dá)沒有明顯差異，而在姜黃素+順鉑聯(lián)合給藥組，CD133+細(xì)胞中的ABCG2的表達(dá)與未處理組CD133-細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)一樣，為低表達(dá)。 體內(nèi)實驗部分： 1.腫瘤生長曲線圖結(jié)果顯示：從給藥后第6天開始，姜黃素+順鉑組的瘤體積開始小于對照組(P=0.014)，從給藥后第9天開始，姜黃素+順鉑組的腫瘤體積開始小于單純姜黃素組(P=0.026)，而從給藥后第12天開始，姜黃素+順鉑組的腫瘤體積開始小于順鉑組(P=0.043)，并且這種差異隨著給藥時間的延長增加，對照組的腫瘤體積與姜黃素組比較則無顯著差異。以上結(jié)果提示提示姜黃素顯著提高了喉癌的的化療敏感性。 2.腫瘤終末體積測量結(jié)果：順鉑+姜黃素組和順鉑組的腫瘤體積相較空白對照組、姜黃素組有所減小，順鉑+姜黃素組腫瘤終末體積減小的更加明顯。 3. Tunel染色實驗檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：在空白對照組和姜黃素組，Tunel染色陽性細(xì)胞的比例分別為24.4±6.2%和25.2±8.8%，沒有明顯的差異；在順鉑組中，Tunel染色陽性細(xì)胞的比例為38.6±7.2%，而在姜黃素+順鉑組，染色陽性細(xì)胞的比例為59.6±6.9%，Tunel染色陽性細(xì)胞的比例,較順鉑組顯著提高，這說明姜黃素有效的提高了喉癌化療后的凋亡發(fā)生。這一結(jié)果與體外實驗所得結(jié)果相一致。 4.利用western blot實驗檢測凋亡相關(guān)性蛋白caspase-3的表達(dá)水平：在空白對照組和姜黃素組中，caspase-3蛋白的表達(dá)水平無顯著差異；在化療組，casepase-3的表達(dá)增加，而在姜黃素+順鉑組的表達(dá)則顯著高于其他三組（P＜0.05），與Tunel染色結(jié)果相一致，這進(jìn)一步肯定姜黃素確實增加了化療癌組織的凋亡發(fā)生。 結(jié)論： 1、聯(lián)合應(yīng)用姜黃素可提高喉癌Hep-2細(xì)胞的化療敏感性。 2、喉癌Hep-2細(xì)胞中存在的少量CD133+細(xì)胞具有化療抵抗性，姜黃素抑制順鉑對Hep-2細(xì)胞中CD133+腫瘤干細(xì)胞的富集，并通過降低ABCG2蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)喉癌Hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的化療抵抗。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2285767