【摘要】： 近年來(lái)細(xì)胞和分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：鼻咽癌基因組存在高頻率3p、9p、11q、13q和14q染色體的等位基因的雜合性丟失。我室陽(yáng)劍波博士采用定位候選克隆的方法從9p區(qū)域克隆了一個(gè)新基因NGX6,Genbank登錄號(hào)為AF188239,它的表達(dá)在鼻咽癌中明顯下調(diào),可能為一個(gè)與鼻咽癌相關(guān)的腫瘤抑制候選基因。 生物信息學(xué)顯示：NGX6基因cDNA全長(zhǎng)2134bp,編碼338aa,預(yù)測(cè)分子量37kDa,含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,胞外區(qū)含有1個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF-like domain)和3個(gè)糖基化位點(diǎn),胞內(nèi)區(qū)較短,含有1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。 NGX6基因前期功能研究結(jié)果表明：NGX6在鼻咽癌活檢組織和鼻咽癌上皮細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)甚至缺失,而在正常鼻咽組織中存在高表達(dá)；NGX6基因在結(jié)直腸癌中亦存在不同程度的表達(dá)下調(diào),伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌樣本中NGX6表達(dá)下調(diào)的比例(15／16)遠(yuǎn)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌樣本(25／34)(P0.05)。利用高通量的組織芯片進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NGX6基因的表達(dá)在有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織下調(diào)更明顯,且與臨床分期相關(guān)。NGX6基因分別轉(zhuǎn)染鼻咽癌和結(jié)腸癌細(xì)胞之后可使鼻咽癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型得到部分逆轉(zhuǎn)；可通過(guò)Ras/Raf/MAPK途徑負(fù)調(diào)控EGFR增殖信號(hào)通路；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NGX6可與作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)者的Ezrin發(fā)生交互作用,CYTO是NGX6和Ezrin發(fā)生交互作用發(fā)生交互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。NGX6高表達(dá)使5-8F細(xì)胞體外侵襲能力減弱,細(xì)胞黏附率增加,恢復(fù)間隙連接細(xì)胞間通訊；成功建立了scid鼠體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移模型,NGX6高表達(dá)能明顯抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞在scid鼠體內(nèi)的成瘤和肺轉(zhuǎn)移灶形成。EGF和CYTO結(jié)構(gòu)域是NGX6調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附的重要功能域,缺失該區(qū)域的突變體細(xì)胞黏附能力較NGX6轉(zhuǎn)染組降低；CYTO是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng),遷移,細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的關(guān)鍵功能域。EGF能誘導(dǎo)鼻咽癌5-8F細(xì)胞發(fā)生運(yùn)動(dòng)和遷移,并發(fā)生一系列的分子水平事件如EGFR, PI3K, RhoA表達(dá)上調(diào),RhoA由胞漿向胞膜移位,侵襲能力增強(qiáng),細(xì)胞通訊能力減弱。NGX6能部分抑制EGF誘導(dǎo)的鼻咽癌5-8F細(xì)胞發(fā)生運(yùn)動(dòng)和遷移,侵襲能力減弱,而且使EGFR, PI3K, RhoA表達(dá)維持誘導(dǎo)前水平,RhoA由胞漿向胞膜移位減少,細(xì)胞通訊能力增強(qiáng)。 綜上所述,NGX6的生物信息學(xué)特征和初步研究結(jié)果提示NGX6基因可能在鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制性的作用。 抗體是基因功能研究重要的工具。為了制備N(xiāo)GX6多克隆抗體,采用pET原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化NGX6△TM2蛋白(第二跨膜區(qū)缺失)。將重組蛋白免疫新西蘭兔,制備獲得抗NGX6蛋白多克隆抗體。該抗體特異性好,效價(jià)高,可應(yīng)用于Western blot (1:3000)、免疫組化(1：1000)以及免疫熒光(1：500)檢測(cè)。應(yīng)用該抗體研究以及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn),NGX6蛋白存在兩個(gè)蛋白亞型a和b,分別來(lái)自3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本。其N(xiāo)CBI參考序列號(hào)分別為：NM_001042589(轉(zhuǎn)錄本1),NM_001042590(轉(zhuǎn)錄本2),NM_016446(轉(zhuǎn)錄本3)。其中,轉(zhuǎn)錄本1和2的ORF框一致,即編碼完全一樣的a蛋白亞型(NGX6a)。轉(zhuǎn)錄本3即NM 016446,也就是我們前期研究的NGX6基因序列,編碼b蛋白亞型(NGX6b)。a蛋白亞型(NGX6a)是新發(fā)現(xiàn)的蛋白亞型,我們從人胎腦文庫(kù)中克隆出了NGX6a的ORF序列。Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示：NGX6a普遍表達(dá)與多種組織和器官中,在神經(jīng)系統(tǒng)、鼻咽、脂肪、膀胱表達(dá)很高,主要定位于上皮組織和神經(jīng)元細(xì)胞；而NGX6b主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中,心,腎,鼻咽,肺,脂肪組織有很弱的表達(dá)。NGX6a在正常組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于NGX6b,是占主要地位的蛋白亞型。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NGX6a蛋白全長(zhǎng)476個(gè)氨基酸,和NGX6b蛋白(338AA)高度同源,兩者之間前272個(gè)氨基酸完全一致。a蛋白亞型和b蛋白亞型一樣具有一個(gè)共同的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF-like domain)。不一樣的是a蛋白亞型具有7個(gè)跨膜區(qū)。通過(guò)Western blot檢測(cè)NGX6a在各種鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào),免疫組織化學(xué)檢測(cè)含有308例鼻咽癌樣品的鼻咽癌組織芯片,NGX6a在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào),并且和轉(zhuǎn)移相關(guān)。 將NGX6a轉(zhuǎn)染入鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、HNE1,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。在這些細(xì)胞株中NGX6a的mRNA水平上調(diào)20倍以上；而在蛋白水平,利用Western Blot檢測(cè)不出有目的蛋白表達(dá)。在使用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細(xì)胞后,在蛋白水平可以檢測(cè)出NGX6a蛋白的表達(dá),表達(dá)水平隨著MG-132濃度的增高而增高。同時(shí),利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到,在用10微摩爾以上濃度的MG-132處理細(xì)胞24小時(shí)以后可以看到細(xì)胞中有熒光出現(xiàn),強(qiáng)度隨MG-132濃度的增高而增高。將pCMV-myc-NGXa轉(zhuǎn)染進(jìn)5-8F細(xì)胞,瞬時(shí)表達(dá)NGXa蛋白,利用偶聯(lián)了myc單克隆抗體的瓊脂糖珠將NGXa蛋白免疫沉淀下來(lái),用泛素抗體檢測(cè),卻檢測(cè)不到任何信號(hào)。結(jié)果表明：NGXa蛋白在鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了降解,這種降解途徑是不依賴(lài)于泛素化的,經(jīng)蛋白酶體的降解。 利用免疫熒光、免疫共沉淀證實(shí)了NGX6a和Ezrin具有交互作用。Ezrin在鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)明顯高于正常鼻咽上皮細(xì)胞株和鼻咽上皮組織,和NGX6a的表達(dá)相反。在鼻咽癌組織芯片中,免疫組織化學(xué)證明了Ezrin在鼻咽癌活檢組織中表達(dá)上調(diào),并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中Ezrin表達(dá)水平高于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織,這種分布模式和NGX6a相反。同樣的,Ezrin在正常人組織表達(dá)分布情況也和NGX6a相反。比如：在神經(jīng)系統(tǒng),NGX6a表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞,而Ezrin表達(dá)在一些膠質(zhì)細(xì)胞中,在神經(jīng)元中不表達(dá)。在小腦的切片中,Ezrin表達(dá)于小腦分子層淺層的星形細(xì)胞及其神經(jīng)纖維,在分子層深層的神經(jīng)纖維和蒲肯野細(xì)胞層沒(méi)有表達(dá)；而NGX6a表達(dá)于分子層深層的神經(jīng)纖維和蒲肯野細(xì)胞內(nèi)。利用過(guò)表達(dá)和RNAi技術(shù)證明了Ezrin介導(dǎo)了NGX6a在細(xì)胞中的降解。通過(guò)構(gòu)建NGX6a一系列突變體,證實(shí)了七次跨膜結(jié)構(gòu)域是NGX6a被Ezrin降解的關(guān)鍵部位。 劃痕實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)了,NGX6a可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞5-8F的傷口愈合和侵襲運(yùn)動(dòng)能力。用RNAi技術(shù)抑制Ezrin表達(dá)后,鼻咽癌5-8F細(xì)胞的侵襲能力下降；而抑制Ezrin表達(dá)的同時(shí)進(jìn)一步提高NGX6a的表達(dá)水平可以進(jìn)一步抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的侵襲能力,和單獨(dú)抑制Ezrin表達(dá)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用SP1抑制劑光輝霉素處理鼻咽癌細(xì)胞5-8F,可以使轉(zhuǎn)錄因子SP1表達(dá)下調(diào),并且下調(diào)Ezrin的表達(dá),上調(diào)NGX6a的表達(dá)水平,從而抑制了5-8F細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在使用光輝霉素抑制Ezrin表達(dá)的同時(shí),加用蛋白酶體抑制劑MG132進(jìn)一步抑制NGX6a的降解,可以明顯抑制鼻咽細(xì)胞5-8F的侵襲轉(zhuǎn)移能力,和分別單用兩種藥物相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明,NGX6a位于Ezrin的下游,被Ezrin降解,是Ezrin促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。 綜上所述,本研究通過(guò)制備N(xiāo)GX6的抗體,檢測(cè)NGX6蛋白在組織中的分布情況,發(fā)現(xiàn)了NGX6a這個(gè)新的蛋白亞型,NGX6a主要分布在上皮組織和神經(jīng)元細(xì)胞中。通過(guò)大樣本鼻咽癌標(biāo)本檢測(cè),NGX6a在鼻咽中表達(dá)下調(diào)并和轉(zhuǎn)移相關(guān)。NGX6a在鼻咽細(xì)胞中發(fā)生降解；Ezrin在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上調(diào)更為明顯；Ezrin在組織內(nèi)的分布情況和NGX6a相反；Ezrin在細(xì)胞內(nèi)和NGX6a發(fā)生交互作用并且介導(dǎo)了NGX6a的降解；NGX6a七次跨膜結(jié)構(gòu)域是其發(fā)生降解的關(guān)鍵部位；降低鼻咽癌細(xì)胞中Ezrin的表達(dá)水平,提高NGX6a的表達(dá)水平可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2283734