發(fā)布時間：2018-10-20 16:37

【摘要】： 近年來細胞和分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：鼻咽癌基因組存在高頻率3p、9p、11q、13q和14q染色體的等位基因的雜合性丟失。我室陽劍波博士采用定位候選克隆的方法從9p區(qū)域克隆了一個新基因NGX6,Genbank登錄號為AF188239,它的表達在鼻咽癌中明顯下調(diào),可能為一個與鼻咽癌相關(guān)的腫瘤抑制候選基因。 生物信息學(xué)顯示：NGX6基因cDNA全長2134bp,編碼338aa,預(yù)測分子量37kDa,含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域,胞外區(qū)含有1個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF-like domain)和3個糖基化位點,胞內(nèi)區(qū)較短,含有1個酪氨酸激酶磷酸化位點。 NGX6基因前期功能研究結(jié)果表明：NGX6在鼻咽癌活檢組織和鼻咽癌上皮細胞株中表達下調(diào)甚至缺失,而在正常鼻咽組織中存在高表達；NGX6基因在結(jié)直腸癌中亦存在不同程度的表達下調(diào),伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌樣本中NGX6表達下調(diào)的比例(15／16)遠高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌樣本(25／34)(P0.05)。利用高通量的組織芯片進行原位雜交實驗發(fā)現(xiàn),NGX6基因的表達在有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織下調(diào)更明顯,且與臨床分期相關(guān)。NGX6基因分別轉(zhuǎn)染鼻咽癌和結(jié)腸癌細胞之后可使鼻咽癌和結(jié)腸癌細胞的惡性表型得到部分逆轉(zhuǎn)；可通過Ras/Raf/MAPK途徑負(fù)調(diào)控EGFR增殖信號通路；免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)NGX6可與作為細胞運動和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)者的Ezrin發(fā)生交互作用,CYTO是NGX6和Ezrin發(fā)生交互作用發(fā)生交互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。NGX6高表達使5-8F細胞體外侵襲能力減弱,細胞黏附率增加,恢復(fù)間隙連接細胞間通訊；成功建立了scid鼠體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移模型,NGX6高表達能明顯抑制鼻咽癌5-8F細胞在scid鼠體內(nèi)的成瘤和肺轉(zhuǎn)移灶形成。EGF和CYTO結(jié)構(gòu)域是NGX6調(diào)節(jié)細胞黏附的重要功能域,缺失該區(qū)域的突變體細胞黏附能力較NGX6轉(zhuǎn)染組降低；CYTO是調(diào)節(jié)細胞運動,遷移,細胞生長增殖的關(guān)鍵功能域。EGF能誘導(dǎo)鼻咽癌5-8F細胞發(fā)生運動和遷移,并發(fā)生一系列的分子水平事件如EGFR, PI3K, RhoA表達上調(diào),RhoA由胞漿向胞膜移位,侵襲能力增強,細胞通訊能力減弱。NGX6能部分抑制EGF誘導(dǎo)的鼻咽癌5-8F細胞發(fā)生運動和遷移,侵襲能力減弱,而且使EGFR, PI3K, RhoA表達維持誘導(dǎo)前水平,RhoA由胞漿向胞膜移位減少,細胞通訊能力增強。 綜上所述,NGX6的生物信息學(xué)特征和初步研究結(jié)果提示NGX6基因可能在鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制性的作用。 抗體是基因功能研究重要的工具。為了制備NGX6多克隆抗體,采用pET原核表達系統(tǒng)表達并純化NGX6△TM2蛋白(第二跨膜區(qū)缺失)。將重組蛋白免疫新西蘭兔,制備獲得抗NGX6蛋白多克隆抗體。該抗體特異性好,效價高,可應(yīng)用于Western blot (1:3000)、免疫組化(1：1000)以及免疫熒光(1：500)檢測。應(yīng)用該抗體研究以及數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn),NGX6蛋白存在兩個蛋白亞型a和b,分別來自3個不同的轉(zhuǎn)錄本。其NCBI參考序列號分別為：NM_001042589(轉(zhuǎn)錄本1),NM_001042590(轉(zhuǎn)錄本2),NM_016446(轉(zhuǎn)錄本3)。其中,轉(zhuǎn)錄本1和2的ORF框一致,即編碼完全一樣的a蛋白亞型(NGX6a)。轉(zhuǎn)錄本3即NM 016446,也就是我們前期研究的NGX6基因序列,編碼b蛋白亞型(NGX6b)。a蛋白亞型(NGX6a)是新發(fā)現(xiàn)的蛋白亞型,我們從人胎腦文庫中克隆出了NGX6a的ORF序列。Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測顯示：NGX6a普遍表達與多種組織和器官中,在神經(jīng)系統(tǒng)、鼻咽、脂肪、膀胱表達很高,主要定位于上皮組織和神經(jīng)元細胞；而NGX6b主要表達于神經(jīng)系統(tǒng)中,心,腎,鼻咽,肺,脂肪組織有很弱的表達。NGX6a在正常組織中的表達遠高于NGX6b,是占主要地位的蛋白亞型。生物信息學(xué)預(yù)測NGX6a蛋白全長476個氨基酸,和NGX6b蛋白(338AA)高度同源,兩者之間前272個氨基酸完全一致。a蛋白亞型和b蛋白亞型一樣具有一個共同的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF-like domain)。不一樣的是a蛋白亞型具有7個跨膜區(qū)。通過Western blot檢測NGX6a在各種鼻咽癌細胞株中表達下調(diào),免疫組織化學(xué)檢測含有308例鼻咽癌樣品的鼻咽癌組織芯片,NGX6a在鼻咽癌中表達下調(diào),并且和轉(zhuǎn)移相關(guān)。 將NGX6a轉(zhuǎn)染入鼻咽癌細胞5-8F、6-10B、HNE1,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。在這些細胞株中NGX6a的mRNA水平上調(diào)20倍以上；而在蛋白水平,利用Western Blot檢測不出有目的蛋白表達。在使用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細胞后,在蛋白水平可以檢測出NGX6a蛋白的表達,表達水平隨著MG-132濃度的增高而增高。同時,利用免疫熒光技術(shù)檢測到,在用10微摩爾以上濃度的MG-132處理細胞24小時以后可以看到細胞中有熒光出現(xiàn),強度隨MG-132濃度的增高而增高。將pCMV-myc-NGXa轉(zhuǎn)染進5-8F細胞,瞬時表達NGXa蛋白,利用偶聯(lián)了myc單克隆抗體的瓊脂糖珠將NGXa蛋白免疫沉淀下來,用泛素抗體檢測,卻檢測不到任何信號。結(jié)果表明：NGXa蛋白在鼻咽癌細胞內(nèi)發(fā)生了降解,這種降解途徑是不依賴于泛素化的,經(jīng)蛋白酶體的降解。 利用免疫熒光、免疫共沉淀證實了NGX6a和Ezrin具有交互作用。Ezrin在鼻咽癌細胞株中表達明顯高于正常鼻咽上皮細胞株和鼻咽上皮組織,和NGX6a的表達相反。在鼻咽癌組織芯片中,免疫組織化學(xué)證明了Ezrin在鼻咽癌活檢組織中表達上調(diào),并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中Ezrin表達水平高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織,這種分布模式和NGX6a相反。同樣的,Ezrin在正常人組織表達分布情況也和NGX6a相反。比如：在神經(jīng)系統(tǒng),NGX6a表達于神經(jīng)元細胞,而Ezrin表達在一些膠質(zhì)細胞中,在神經(jīng)元中不表達。在小腦的切片中,Ezrin表達于小腦分子層淺層的星形細胞及其神經(jīng)纖維,在分子層深層的神經(jīng)纖維和蒲肯野細胞層沒有表達；而NGX6a表達于分子層深層的神經(jīng)纖維和蒲肯野細胞內(nèi)。利用過表達和RNAi技術(shù)證明了Ezrin介導(dǎo)了NGX6a在細胞中的降解。通過構(gòu)建NGX6a一系列突變體,證實了七次跨膜結(jié)構(gòu)域是NGX6a被Ezrin降解的關(guān)鍵部位。 劃痕實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗證實了,NGX6a可以明顯抑制鼻咽癌細胞5-8F的傷口愈合和侵襲運動能力。用RNAi技術(shù)抑制Ezrin表達后,鼻咽癌5-8F細胞的侵襲能力下降；而抑制Ezrin表達的同時進一步提高NGX6a的表達水平可以進一步抑制鼻咽癌5-8F細胞的侵襲能力,和單獨抑制Ezrin表達相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。使用SP1抑制劑光輝霉素處理鼻咽癌細胞5-8F,可以使轉(zhuǎn)錄因子SP1表達下調(diào),并且下調(diào)Ezrin的表達,上調(diào)NGX6a的表達水平,從而抑制了5-8F細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在使用光輝霉素抑制Ezrin表達的同時,加用蛋白酶體抑制劑MG132進一步抑制NGX6a的降解,可以明顯抑制鼻咽細胞5-8F的侵襲轉(zhuǎn)移能力,和分別單用兩種藥物相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。這表明,NGX6a位于Ezrin的下游,被Ezrin降解,是Ezrin促進腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。 綜上所述,本研究通過制備NGX6的抗體,檢測NGX6蛋白在組織中的分布情況,發(fā)現(xiàn)了NGX6a這個新的蛋白亞型,NGX6a主要分布在上皮組織和神經(jīng)元細胞中。通過大樣本鼻咽癌標(biāo)本檢測,NGX6a在鼻咽中表達下調(diào)并和轉(zhuǎn)移相關(guān)。NGX6a在鼻咽細胞中發(fā)生降解；Ezrin在鼻咽癌組織中表達上調(diào),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上調(diào)更為明顯；Ezrin在組織內(nèi)的分布情況和NGX6a相反；Ezrin在細胞內(nèi)和NGX6a發(fā)生交互作用并且介導(dǎo)了NGX6a的降解；NGX6a七次跨膜結(jié)構(gòu)域是其發(fā)生降解的關(guān)鍵部位；降低鼻咽癌細胞中Ezrin的表達水平,提高NGX6a的表達水平可以明顯抑制鼻咽癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2283734