【摘要】：研究背景 糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是目前危害中老年人視力最主要的致盲眼病之一。DR的發(fā)生和發(fā)展與多種因素相關,如高血糖、氧化應激、糖基化終末產物、細胞凋亡、細胞因子等。近年來許多學者都明確提出免疫機制參與DR的發(fā)生發(fā)展,DR也是一種自身免疫性疾病。免疫學發(fā)病機制逐漸成為DR的研究熱點,主要集中在四個方面：(1)自身抗原和免疫細胞的異常表達誘導DR的自身免疫反應[4-8]；(2)炎癥細胞和前炎癥因子參與DR的病理過程;(3)抗炎藥物對DR具有明確的治療作用；(4)免疫遺傳因素影響DR的發(fā)生。綜上所述,DR雖然以視網膜微血管病變?yōu)椴±砘A,但卻是自身免疫應答、炎癥性免疫反應、免疫遺傳等在內的多因素多途徑綜合作用的結果。 細胞凋亡和炎癥反應是DR的重要病理變化。激活誘導的細胞凋亡參與了細胞免疫狀態(tài)的維持。免疫反應早期淋巴細胞被激活,進而引起細胞因子和細胞表面分子的變化,產生炎癥反應。輔助性T細胞(help T cell, Th細胞)是體內一類重要的免疫調節(jié)細胞,Th細胞根據(jù)分泌細胞因子和功能不同可分為Th0、Th1、Th2、Th3、Th17亞群,其中Th1細胞主要分泌IFN-γ、Th2細胞主要分泌IL-4。Th細胞主要通過調節(jié)細胞因子表達量改變免疫狀態(tài)。探討DR患者激活誘導細胞凋亡和細胞因子的變化,可以更好的了解DR患者的免疫狀態(tài)。 共刺激信號已經成為免疫學研究的一個熱點領域。程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)及其配體(programmed death-ligands, PD-Ls)屬于CD28/B7家族,PD-1主要表達于活化的T細胞、B細胞；配體PD-L1和PD-L2主要表達于抗原提呈細胞,且PD-L1的表達更易被激活誘導。PD-1通過與PD-L1、PD-L2的IgV樣結構域結合,將信號傳至其細胞質區(qū)尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序,從而抑制T細胞的活化和細胞因子的分泌。PD-1及其配體屬于抑制性共刺激分子,其在自身免疫性疾病、器官移植排斥反應、病原微生物感染、腫瘤免疫逃逸等方面都發(fā)揮著重要作用[22-24]。 綜上所述,免疫機制參與了DR的發(fā)生發(fā)展,PD-1/PD-Ls信號通路作為重要的免疫抑制通路,我們推測它可能對DR的發(fā)生發(fā)展具有調節(jié)作用。本課題以DR作為研究主體,以PD-1信號通路作為研究對象,以外周血作為研究靶點,從激活誘導的細胞凋亡和Thl/Th2類細胞因子出發(fā),觀察PD-1信號通路在糖尿病視網膜病變患者中的表達及功能特點,探討PD-1/PD-Ls信號通路在DR發(fā)病機制中的作用,以期為DR的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù),為此類疾病的預防和和治療提供新的思路和方法。 第一部程序性死亡分子1及其配體在糖尿病視網膜病變患者外周血中的表達 目的：探討PD-1及其配體PD-L1和PD-L2在2型糖尿病視網膜病變患者外周血淋巴細胞中的表達和意義。 方法：臨床檢查確診為增殖性糖尿病視網膜病變患者(proliferative diabetic retinopathy, PDR)41例,非增殖性糖尿病視網膜病變患者(nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR)28例,糖尿病無視網膜病變患者(diabetes mellitus and no diabetic retinopathy, DM-NDR)27例,同期行體檢的健康志愿者59例納入研究。收集受檢者晨起空腹EDTA靜脈抗凝血2ml,采用實時定量聚合酶鏈式反應(Real time polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測PD-1、PD-L1、PD-L2mRNA的表達水平,分析各組間表達水平的差異。 結果：RT-PCR檢測結果顯示,PDR患者外周血淋巴細胞PD-1、PD-L1mRNA相對表達量比DM-NDR組及對照組降低,差異有統(tǒng)計學意義(PD-1: P=0.004; PD-L1:P=0.001)。PD-L2mRNA在PDR患者中也有降低的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.267)。 結論：PDR患者外周血淋巴細胞PD-1、PD-L1mRNA相對表達量降低,提示免疫應答可能參與PDR的發(fā)病機制。 第二部分程序性死亡分子1通路對糖尿病視網膜病變激活誘導的細胞凋亡調控機制的研究 目的：探討PD-1/PD-Ls信號通路對2型糖尿病視網膜病變激活誘導的細胞凋亡(activation-induced cell death, AICD)調控的機制。 方法：臨床檢查確診為PDR患者24例,DM-NDR患者15例,同期行體檢的健康志愿者15例納入研究。收集受檢者晨起空腹肝素靜脈抗凝血4ml,分離淋巴細胞,使用植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)40μg/ml刺激淋巴細胞48小時,采用流式細胞技術檢測細胞凋亡情況,觀察細胞表面PD-1、PD-L1、PD-L2蛋白的表達,分析PD-1/PD-Ls信號通路對PDR患者AICD的調控。 結果：流式細胞結果顯示,PDR組的細胞凋亡率高于DM-NDR組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037,0.000), DM-NDR組的細胞凋亡率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.048)。PDR組的PD-1蛋白表達率和凋亡細胞表面的PD-1蛋白表達率均高于DM-NDR組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042,0.000; P=0.024,0.000), DM-NDR組的PD-1蛋白表達率和凋亡細胞表面的PD-1蛋白表達率和對照組相比,也有顯著增高(P=0.031:P=0.037).PDR組的PD-L1蛋白表達率和凋亡細胞表面的PD-L1蛋白表達率均低于DM.NDR組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000,0.009；P=-0.000,0.005),而DM.NDR組的PD-L1蛋白表達率和凋亡細胞表面的PD-L1蛋白表達率卻顯著高于對照組(P=-0.035；P=0.003)。三組均無PD-L2蛋白的表達。 結論：PDR患者存在激活誘導的細胞凋亡增高的現(xiàn)象。PD-1信號通路通過AICD介導增殖性糖尿病視網膜病變的發(fā)生發(fā)展。DM-NDR患者的PD-L1蛋白表達和PDR患者相比反而增高,提示PD-L1可能保護糖尿病患者免受眼部損害。 第三部分程序性死亡分子1通路對Th1/Th2細胞因子調控機制的研究 目的：觀察2型糖尿病視網膜病變Th1/Th2類細胞因子的表達,研究PD-1信號通路對2型糖尿病視網膜病變Th1/Th2類細胞因子的調控,從細胞因子角度探討DR的發(fā)病機制。 方法：臨床檢查確診為PDR患者、DM-NDR患者和同期行體檢的健康志愿者各15例納入研究。收集受檢者晨起空腹肝素靜脈抗凝血4ml,分離淋巴細胞,使用50ng/ml PMA,1μg/ml Ionomycin刺激淋巴細胞4小時,1.7μg/ml Monensin固定胞內細胞因子。采用流式細胞技術檢測IFN-γ和IL-4的表達；觀察PDR患者Th1/Th2比值的變化；分析PDR患者PD-1和Th1/Th2類細胞因子的相關性。 結果：流式細胞結果顯示,PDR組的IFN-γ和IL-4表達均高于DM-NDR組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(IFN-γ:P=0.028,0.000; IL-4:P=0.012,0.032).與DM-NDR組及對照組相比,PDR組PD-1+IFN-γ+細胞率顯著增高(P=0.011,0.001),同時,PD-1+IL-4+細胞也顯著增高(P=0.040,0.003)。IFN-γ+細胞和IL-4+細胞的比值在PDR組高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047),但PD-1+IFN-γ+細胞和PD-1+IL-4+細胞的比值在各組間無差異(P=0.590)。 結論：PDR患者表現(xiàn)出以Thl為主的炎癥反應。PD-1與PDR的Th1/Th2類細胞因子變化具有相關性,但與Th1/Th2比值變化并無關聯(lián),提示PD-1并非通過Th1/Th2失衡調控PDR的發(fā)展。 第四部分糖尿病視網膜病變危險因素的相關性分析 目的：觀察PDR患者血β2微球蛋白的表達,分析血β2微球蛋白和前觀察指標的相關性,探討PD-1信號通路、凋亡、Th1/Th2類細胞因子對糖尿病微血管病變的臨床預測性。 方法：使用放射免疫法檢測血β2微球蛋白的表達,分析血膽微球蛋白的表達與前觀察指標的相關性,前觀察指標均為前部分實驗中流式細胞儀檢測部分的結果,包括：PD-1蛋白、PD-L1蛋白、IFN-γ、IL-4、凋亡細胞率、AnnexinV+PI-PD-1+細胞、AnnexinV+PI-PD-L1+細胞、PD-1+IFN-γ+細胞、PD-1+IL-4+細胞。 結果：PDR患者的血p2微球蛋白表達量為(3.07±1.79)mg/l,高于DM-NDR組(2.11±0.71)mg/l和對照組(1.73+0.53)mg/l,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028,0.000)。PDR患者血p2微球蛋白和凋亡細胞率(r=0.484,P=0.017)、IFN-γ(r=0.523, P=0.045)呈正相關,和PD-1蛋白(r=-0.515,P=0.034)、PD-L1蛋白(r=-0.765, P=0.004)、IL-4(r=-0.573,P=0.026)、AnnexinV+PI-PD-1+細胞率(r=-0.625,P=0.010)呈負相關。 結論：糖尿病腎病和糖尿病視網膜病變同屬于微血管病變,在臨床上有密切關聯(lián)。PD-1信號通路和Th1/Th2類細胞因子與糖尿病微血管病變的發(fā)展有一定的相關性,為臨床預測及診斷治療提供了理論依據(jù)。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R774.1

【參考文獻】

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1 向紅丁;張化冰;;ADA:糖尿病醫(yī)學診治標準—2 0 1 0(摘要)[J];中國糖尿病雜志;2010年03期

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本文編號：2268518