發(fā)布時間：2018-10-13 11:07

【摘要】：目的探討體外培養(yǎng)原發(fā)性開角型青光眼(POAG)小梁網(wǎng)細胞的培養(yǎng)方法及其生物學特性,并在此基礎上研究原發(fā)性開角型青光眼小梁網(wǎng)細胞是否表達表皮生長因子(EGF)及其受體(EGFR),EGF對POAG小梁網(wǎng)細胞增殖和凋亡的影響及EGF對小梁網(wǎng)細胞表達EGFR的影響。 方法采用組織塊培養(yǎng)法進行POAG小梁網(wǎng)細胞的體外培養(yǎng),用倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫細胞化學法染色等方法觀察體外培養(yǎng)的POAG小梁網(wǎng)細胞生物學特性并進行細胞鑒定。采用ELISA法檢測體外培養(yǎng)的POAG小梁網(wǎng)細胞是否表達EGF及EGFR;采用CCK-8法和流式細胞術檢測體外培養(yǎng)的第5代小梁網(wǎng)細胞經(jīng)EGF終濃度分別為0ng/ml(對照組),5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml和100ng/ml的DMEM/F12處理48小時后小梁網(wǎng)細胞的增殖率和凋亡率;ELISA法檢測小梁網(wǎng)細胞經(jīng)EGF終濃度為0ng/ml,50ng/ml的DMEM/F12處理48小時后小梁網(wǎng)細胞EGFR的表達。 結(jié)果 1.組織塊培養(yǎng)10天左右可見細胞從其邊緣向外生長,透射電鏡、免疫細胞化學染色證明其為POAG小梁網(wǎng)細胞。 2.ELISA檢測結(jié)果顯示小梁網(wǎng)細胞表達EGF和EGFR,其ELISA檢測的吸光度值(OD值)分別為0.13、0.33,計算出POAG小梁網(wǎng)細胞培養(yǎng)上清液中EGF及EGFR的表達量分別為1.25ng/ml、0.89ng/ml。 3.運用CCK-8法對經(jīng)EGF終濃度為0g/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml的DMEM/F12處理的實驗組細胞進行檢測,其吸光度值(OD)分別為(0.75±0.05),(0.80±0.07),(0.84±0.05),(0.89±0.02),(0.77±0.04),與對照組(0.66±0.05)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.運用流式細胞儀對經(jīng)EGF終濃度為0 ng/ml(對照組),5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml的DMEM/F12處理48h的細胞進行檢測,小梁網(wǎng)細胞的凋亡率分別為(16.14±0.44)%,(14.22±0.18)%,(10.90±0.49)%,(5.98±0.14)%,(5.58±0.21)%,(9.93±0.17)%,各濃度組與陰性對照組比較,凋亡率下降具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.經(jīng)EGF終濃度為50ng/m的DMEM/F12處理的細胞EGFR的表達量的OD值為(0.20±0.01),與陰性對照組的OD值(0.17±0.01)相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論 l.掌握POAG小梁網(wǎng)細胞的體外細胞培養(yǎng)技術及其生長特點、超微結(jié)構,能夠成功地進行POAG小梁網(wǎng)細胞的體外培養(yǎng)及鑒定。 2.體外培養(yǎng)的POAG小梁網(wǎng)細胞上清液中表達EGF及EGFR。 3.EGF能促進小梁網(wǎng)細胞的增殖,減緩其凋亡,并在一定的范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。 4.EGF能夠促進小梁網(wǎng)細胞表達EGFR。
[Abstract]:Objective to investigate the culture methods and biological characteristics of (POAG) trabecular meshwork cells in primary open-angle glaucoma in vitro. The effects of EGF (EGF) and its receptor (EGFR), EGF on the proliferation and apoptosis of POAG trabecular reticulum cells and the effect of EGF on the expression of EGFR in trabecular meshwork cells of primary open-angle glaucoma were studied. Methods POAG trabecular meshwork cells were cultured in vitro by tissue mass culture. The biological characteristics of POAG trabecular meshwork cells cultured in vitro were observed and identified by inverted microscope, transmission electron microscope and immunocytochemical staining. ELISA assay was used to detect the expression of EGF in cultured POAG trabecular meshwork cells and EGFR; was used to detect the final EGF concentration of the 5th generation trabecular meshwork cells cultured in vitro by CCK-8 and flow cytometry. The final concentrations of EGF were 0ng/ml (control group), 5 ng / ml 10 ng / ml and 50 ng / ml 100ng/ml DMEM/F12 respectively. ELISA assay was used to detect the expression of EGFR in trabecular meshwork cells treated with DMEM/F12 of 0 ng / ml 50 ng / ml for 48 hours. Result 1. About 10 days after the tissue mass was cultured, the cells grew from the edge to the outside, and transmission electron microscopy (TEM) was used. Immunocytochemical staining showed that the cells were POAG trabecular meshwork cells. 2.ELISA showed that trabecular meshwork cells expressed EGF and EGFR, their ELISA absorbance values (OD) were 0.13 ~ 0.33, respectively. The expression of EGF and EGFR were 1.25 ng 路ml ~ (-1) 路ml ~ (-1) and 0.89 ng 路ml ~ (-1) 路ml ~ (-1), respectively. CCK-8 method was used to detect the cells of the experimental group treated with 10 ng / ml DMEM/F12 of 0 g / ml 10 ng / ml DMEM/F12. The absorbance (OD) of the experimental group was (0.75 鹵0.05), (0.80 鹵0.07), (0.84 鹵0.05), (0.89 鹵0.02), (0.77 鹵0.04), which was significantly higher than that of the control group (0.66 鹵0.05) (P 0.05), and the mean value of (OD) was 0.75 鹵0.05), (0.80 鹵0.07), (0.84 鹵0.05), (0.89 鹵0.02), (0.77 鹵0.04, compared with the control group (0.66 鹵0.05). The apoptosis rate of trabecular meshwork cells was (16.14 鹵0.44)%, (14.22 鹵0.18)%, (10.90 鹵0.49)%, (5.98 鹵0.14)%, (5.58 鹵0.21)%, (9.93 鹵0.17)%, respectively. The apoptosis rates of cells treated with DMEM/F12 of 50 ng / ml DMEM/F12 for 48 h were (16.14 鹵0.44)%, (14.22 鹵0.18)%, (10.90 鹵0.49)%, (5.98 鹵0.14)%, (5.58 鹵0.21)%, (9.93 鹵0.17)%, respectively. The decrease of apoptosis rate was statistically significant (P0.05). The OD value of EGFR expression in DMEM/F12 treated with 50ng/m was (0.20 鹵0. 01), which was significantly higher than that in negative control group (0. 17 鹵0. 01) (P0.05). Conclusion _ _ _. The in vitro culture technique and growth characteristics and ultrastructure of POAG trabecular meshwork cells can be successfully carried out in vitro culture and identification of POAG trabecular meshwork cells. 2. The expression of EGF and EGFR. 3.EGF in the supernatant of POAG trabecular meshwork cells in vitro can promote the proliferation of trabecular meshwork cells and slow down their apoptosis. 4.EGF can promote the expression of EGFR. in trabecular meshwork cells.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R775

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