發(fā)布時(shí)間：2018-10-12 20:57

【摘要】：第一部分：人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的建立此部分研究旨在通過采集喉癌標(biāo)本組織直接進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)來建立一株新的能夠代表近年來中國喉癌喉人群部分發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)特征的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系。本研究中,我們嘗試收集了2011年6月-2011年12月在我院確診為喉鱗狀細(xì)胞癌的40位患者的喉癌組織標(biāo)本,其中會(huì)厭癌29例,聲門癌8例,頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)3例,均為男性患者,年齡46-68歲。將收集的標(biāo)本組織在24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行洗滌、消毒、機(jī)械剪碎及膠原酶消化后直接進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)或組織塊培養(yǎng),對生長出的喉癌上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代、純化、流式細(xì)胞儀及免疫熒光純度測定、定期凍存、支原體污染檢測及復(fù)蘇活性測定。同時(shí)采集癌旁正常上皮組織進(jìn)行同法原代培養(yǎng),作為腫瘤細(xì)胞的對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：喉癌組織或細(xì)胞在體外直接進(jìn)行原代培養(yǎng)比較困難,細(xì)菌及真菌污染和癌細(xì)胞不貼壁是培養(yǎng)過程中的主要問題,即使貼壁生長,絕大多數(shù)不超過3代。從40例喉癌標(biāo)本中我們僅成功建立了一株新的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系,命名為FD-LSC-1,來自于一位未經(jīng)治療的分化良好的會(huì)厭鱗癌伴雙頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(IVa, T4aN2M0)的68歲男性患者的會(huì)厭病灶,該患者沒有喉癌家族史,但有40余年的吸煙史及30余年的飲酒史。FD-LSC-1細(xì)胞在體外傳代超過100代,癌細(xì)胞已純化,沒有支原體污染,凍存后復(fù)蘇的FD-LSC-1細(xì)胞活性良好。癌旁正常上皮也成功培養(yǎng)傳代到第8代。以上結(jié)果表明：人喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系已經(jīng)初步建立達(dá)永生化；喉鱗癌原代細(xì)胞在體外較難成活和培養(yǎng)建系,可能與喉癌病灶大多原發(fā)于有菌腔道且與空氣、消化液或痰液接觸有關(guān)；成功建立能夠在體外穩(wěn)定生長和連續(xù)傳代的喉鱗癌細(xì)胞系是一項(xiàng)艱苦的工作,需要經(jīng)過多次嘗試和多次失敗才能偶獲成功。第二部分：人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的鑒定此部分研究旨在對新建立的喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,包括三部分內(nèi)容：首先是種屬鑒定,確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是人來源的；其次是細(xì)胞組織來源鑒定,確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是上皮組織細(xì)胞來源的；最后是惡性生物學(xué)特征的鑒定,確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是惡性腫瘤。本研究中,首先利用目前最權(quán)威的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)圖譜技術(shù)對FD-LSC-1細(xì)胞系的17個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列基因座及一個(gè)性別決定基因座(Amelogenin)進(jìn)行了檢測分析,通過美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)對檢測結(jié)果進(jìn)行了種屬鑒定,并與美國ATCC及歐洲微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)中的遺傳信息進(jìn)行比對,檢測有無被現(xiàn)存的任何細(xì)胞系污染；其次,利用相差顯微鏡觀察FD-LSC-1細(xì)胞的形態(tài),利用免疫熒光法檢測FD-LSC-1細(xì)胞廣譜角蛋白及波形蛋白的表達(dá)情況,利用透射電鏡技術(shù)檢查上皮超微結(jié)構(gòu)；最后,對FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了惡性生物學(xué)特征的鑒定,包括：吉姆薩(Giemsa)染色形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查、染色體組核型分析、流式細(xì)胞儀DNA倍體分析、軟瓊脂集落形成能力檢測及免疫缺陷小鼠致瘤能力的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：首先,美國ATCC的檢測報(bào)告確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是人來源的細(xì)胞系,并且沒有受到美國ATCC及歐洲D(zhuǎn)SMZ細(xì)胞庫中任何細(xì)胞系的污染。其次,相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞呈鵝卵石樣單層貼壁生長,胞漿內(nèi)�？梢娍张�,與人喉表皮樣癌HEp-2細(xì)胞系的多邊形不同；細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞為廣譜角蛋白陽性而波形蛋白陰性；透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞之間可見橋粒,胞漿內(nèi)可見張力絲等上皮超微結(jié)構(gòu)。最后,對FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行的惡性生物學(xué)特征檢測發(fā)現(xiàn)：Giemsa染色的FD-LSC-1細(xì)胞核分裂像明顯活躍,胞核大,核漿比例增大,可見巨核細(xì)胞；透射電鏡癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體、核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富：染色體組核型分析提示FD-LSC-1細(xì)胞系存在明顯的數(shù)量異常和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)異常,染色體眾數(shù)為68,為近3倍體,結(jié)構(gòu)異常包括染色體增加、缺失及易位等；流式細(xì)胞儀DNA倍體及細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),與宮頸癌Hela細(xì)胞系相比,FD-LSC-1細(xì)胞系G0/G1期比例下降,S期比例增高,而G2/M期比例類似；FD-LSC-1細(xì)胞系未能夠在半固體軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落；FD-LSC-1細(xì)胞能夠順利在免疫缺陷小鼠皮下形成移植瘤,移植瘤HE(hematoxylin eosin)染色病理提示為高分化鱗癌。以上結(jié)果表明：經(jīng)過種屬、組織來源及惡性生物學(xué)特征的鑒定,新建立的FD-LSC-1細(xì)胞系符合癌細(xì)胞系所必需的各項(xiàng)生物學(xué)特征,可以確認(rèn)是人喉上皮組織來源的高分化鱗癌細(xì)胞系,且沒有被目前存在的任何細(xì)胞系污染。第三部分：人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的特征分析此部分研究旨在對已經(jīng)過鑒定的人高分化喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行個(gè)性化的特征分析,包括：體外培養(yǎng)群體倍增時(shí)間、遷移侵襲潛能、放化療敏感性、Notchl及EGFR (epidermal growth factor receptor)通路、CK(cytokeratin) 5及Ki67的蛋白水平、TP53基因突變、人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染、頭頸鱗癌相關(guān)分子標(biāo)記物檢測、頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)基因檢測及頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)microRAN檢測,為FD-LSC-1細(xì)胞系貼上個(gè)性化的特征標(biāo)簽。本研究中,利用CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒對FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了體外培養(yǎng)的群體倍增時(shí)間測定,以Hela細(xì)胞系為對照利用包被基質(zhì)膠的Transwell小室對FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了遷移及侵襲能力的檢測,再以Hela細(xì)胞系為對照利用X射線及順鉑對FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了放化療敏感性的檢測,利用Western Blot技術(shù)對FD-LSC-1細(xì)胞系的Notch、EGFR、CK5及Ki67的蛋白水平進(jìn)行了檢測,利用基因測序技術(shù)對FD-LSC-1細(xì)胞系TP53抑癌基因的全部外顯子進(jìn)行了突變檢測,利用兩對通用引物結(jié)合PCR (polymerase chain reaction)技術(shù)對FD-LSC-1細(xì)胞系的HPV感染情況進(jìn)行了檢測,利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)對FD-LSC-1細(xì)胞系的頭頸鱗癌相關(guān)重要分子標(biāo)記進(jìn)行了檢測,利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR,quantitative rael-time polymerase chain reaction)對FD-LSC-1細(xì)胞系的頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)基因進(jìn)行了檢測以及利用TaqMan探針qRT-PCR技術(shù)對FD-LSC-1細(xì)胞系頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)miRNA進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FD-LSC-1細(xì)胞系在體外培養(yǎng)的群體倍增時(shí)間約為24小時(shí),FD-LSC-1細(xì)胞系比Hela細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移及侵襲潛能但對放化療相對更敏感,FD-LSC-1細(xì)胞系具有激活的Notchl和EGFR信號通路以及上調(diào)的CK5和Ki67蛋白水平, FD-LSC-1細(xì)胞系TP53基因第5和8外顯子分別發(fā)生了錯(cuò)義突變和無義突變,FD-LSC-1細(xì)胞系沒有被HPV感染,FD-LSC-1細(xì)胞系表達(dá)ADAM10及MLH1等重要的頭頸鱗癌相關(guān)分子標(biāo)記物,SYBR Green qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了FD-LSC-1細(xì)胞系有TERT等14個(gè)頭頸鱗癌相關(guān)上調(diào)基因及KRT4等14個(gè)下調(diào)基因,TaqMan探針qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了FD-LSC-1細(xì)胞系有miRNA-21等9個(gè)頭頸鱗癌相關(guān)上調(diào)miRNA及miRNA-138等10個(gè)下調(diào)miRNA。以上結(jié)果表明：經(jīng)過對已鑒定的人高分化喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行倍增時(shí)間等9項(xiàng)個(gè)性化的生物學(xué)特征分析之后,FD-LSC-1細(xì)胞系已經(jīng)被建立、鑒定及較好地特征化,為進(jìn)一步有針對性地利用FD-LSC-1細(xì)胞系對我國喉鱗癌人群的發(fā)病機(jī)制及腫瘤生物學(xué)特性進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2267574