發(fā)布時(shí)間：2018-08-23 20:20

【摘要】：[目的]糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy, DR)是常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥,為發(fā)達(dá)國(guó)家工作年齡人群中致盲率最高的疾病。SIRT1屬于第Ⅲ組蛋白去乙�；�,與DR發(fā)病相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的目的為初步探討SIRT1在DR纖維血管膜形成中的作用,研究SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇是否對(duì)高糖培養(yǎng)的RPE細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng),及其相關(guān)機(jī)制。同時(shí)初步研究與白藜蘆醇結(jié)構(gòu)相近的二苯乙烯苷是否具有類似作用。 [方法]采集DR伴眼底纖維血管膜患者、非糖尿病伴特發(fā)性黃斑前膜患者眼部標(biāo)本,石蠟包埋切片,行免疫組化檢測(cè)兩組患者SIRT1表達(dá)的差異。體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,加入5.5mmol/L葡萄糖,5.5mmol/L葡萄糖加上甘露醇,25mmol/L葡萄糖,25mmol/L葡萄糖及不同濃度白藜蘆醇、二苯乙烯苷,分別檢測(cè)以下指標(biāo)的變化情況：(1)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；(2)RT-PCR檢測(cè)SIRT1、PGC-1α基因表達(dá)水平；(3)Western blot檢測(cè)乙�；疦F-κB p65含量及AMPK活性；(4)ELISA法檢測(cè)VEGF分泌量。 [結(jié)果]共收集DR患者纖維血管膜12例,非糖尿病患者黃斑前膜7例,纖維血管膜中SIRT1陽(yáng)性率高于黃斑前膜組織(100%vs28.6%),去掉年齡因素影響后,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.021)。25mmol/L葡萄糖能降低人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活力、抑制SIRT1及PGC-1α轉(zhuǎn)錄,激活NF-κB、抑制AMPK活性,促進(jìn)VEGF分泌。加入一定濃度的白藜蘆醇或二苯乙烯苷,可抑制高糖引起的細(xì)胞活力下降,減少SIRT1轉(zhuǎn)錄下降的水平,減少NF-κB的激活,VEGF分泌量也相應(yīng)降低。同時(shí),一定濃度的白藜蘆醇及二苯乙烯苷可以減少高糖對(duì)PGC-1α轉(zhuǎn)錄的抑制作用,其幅度與對(duì)應(yīng)的SIRT1、NF-κB改變水平并不完全一致,但與AMPK的活性變化量基本一致。 [結(jié)論]DR患者纖維血管膜中SIRT1表達(dá)升高,提示SIRT1與DR新生血管有一定關(guān)系。但高糖可抑制體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中SIRT1的表達(dá),上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示體外實(shí)驗(yàn)可能不能完全反映視網(wǎng)膜的生理情況；或者DR病情進(jìn)展過(guò)程中,SIRT1的含量在不斷變化。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示二苯乙烯苷可能也具有SIRT1激動(dòng)劑的作用,且白藜蘆醇及二苯乙烯苷可能是通過(guò)SIRT1—NF-κB通路降低VEGF分泌。同時(shí)PGC-1α mRNA水平可能與AMPK活性相關(guān)。
[Abstract]:[objective] Diabetic retinopathy (Diabetic retinopathy, DR) is a common diabetic microvascular complication. SIRT1 belongs to the third histone deacetylase and is associated with the pathogenesis of DR. The purpose of this study was to investigate the role of SIRT1 in the formation of vascular membranes of DR fibers, and to investigate whether resveratrol, a SIRT1 agonist, has protective effect on RPE cells cultured with high glucose and its related mechanisms. At the same time, we also studied whether stilbene glycoside, which is similar to resveratrol, has similar effect. [methods] the ocular specimens of DR patients with fundus fibrovascular membrane and non-diabetic patients with idiopathic macular membrane were collected and embedded in paraffin sections. The difference of SIRT1 expression between the two groups was detected by immunohistochemistry. In vitro cultured human retinal pigment epithelial cells (RPE) were cultured with 5.5mmol/L glucose 5.5 mmol / L glucose + mannitol 25 mmol / L glucose and resveratrol, stilbene glucoside at different concentrations. The following indexes were detected: (1) CCK-8 method was used to detect cell viability; (2) SIRT1,PGC-1 偽 gene expression was detected by RT-PCR, (3) acetylated NF- 魏 B p65 and AMPK activity were detected by) Western blot, and (4) VEGF secretion was detected by ELISA assay. [results] A total of 12 patients with DR and 7 patients with non-diabetic macular membrane were collected. The positive rate of SIRT1 in fibrovascular membrane was higher than that in macular membrane tissue (100% vs 28.6%). The difference was statistically significant (p0. 021). 25 mmol / L glucose could decrease the activity of human retinal pigment epithelial cells, inhibit the transcription of SIRT1 and PGC-1 偽, activate NF- 魏 B, inhibit the activity of AMPK and promote the secretion of VEGF. A certain concentration of resveratrol or stilbene could inhibit the decrease of cell viability, decrease the level of SIRT1 transcription, and decrease the secretion of NF- 魏 B. At the same time, resveratrol and stilbene at a certain concentration could reduce the inhibitory effect of high glucose on PGC-1 偽 transcription, the amplitude of which was not completely consistent with the change level of SIRT1,NF- 魏 B, but it was basically consistent with the activity change of AMPK. [conclusion] the increased expression of SIRT1 in fibrovascular membrane of DR patients suggests that SIRT1 is related to DR neovascularization. However, high glucose could inhibit the expression of SIRT1 in cultured human retinal pigment epithelial cells. These results suggest that the in vitro experiments may not completely reflect the physiological conditions of the retina, or the content of SIRT1 is constantly changing during the progression of DR. These results suggest that stilbene glucoside may also have the effect of SIRT1 agonist, and resveratrol and stilbene glycoside may decrease VEGF secretion through SIRT1-NF- 魏 B pathway. At the same time, the level of PGC-1 偽 mRNA may be related to the activity of AMPK.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2199815