發(fā)布時(shí)間：2018-07-22 11:24

【摘要】： 前言 后發(fā)性白內(nèi)障是現(xiàn)代白內(nèi)障手術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥,可引起視力的再次低下,又稱后囊膜混濁(posterior capsular opacification, PCO)。白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells, LECs)發(fā)生增殖、遷移、纖維化生并伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌是PCO形成的主要原因,而晶狀體上皮細(xì)胞的增殖最為關(guān)鍵。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于通過(guò)藥物等方法抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的研究。 目前,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞增殖機(jī)制研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),PI3K/AKT(phosphati-dylinositol-3 kinase/AKT,磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B)信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖及凋亡均有重要調(diào)控作用[3],而LY294002作為該信號(hào)通路的特異性抑制劑,能夠抑制細(xì)胞的增殖。S期激酶相關(guān)蛋白2(S phase kinase associated protein2,Skp2)作為該通路下游的靶調(diào)控因子,能夠介導(dǎo)細(xì)胞周期因子降解而調(diào)控細(xì)胞的增殖。本研究應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002處理體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01／04,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響及研究可能的相關(guān)機(jī)制,為臨床后發(fā)性白內(nèi)障的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。 材料與方法 一、材料 人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01／04由北京中國(guó)科學(xué)院腫瘤研究所提供。 二、方法 1、細(xì)胞培養(yǎng),人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01／04在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。 2、細(xì)胞分組,實(shí)驗(yàn)組加入25μmol／L的P13K抑制劑LY294002,對(duì)照組加入等體積DMSO。 3、應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖的影響,繪制生長(zhǎng)曲線,篩選LY294002的最佳作用時(shí)間。 4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞周期的影響。 5、應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞Skp2蛋白表達(dá)的影響。 6、應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞Skp2mRNA表達(dá)的影響。 三、統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)以x±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用t檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、PI3K抑制劑LY294002抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖 MTT法檢測(cè)得出：實(shí)驗(yàn)組吸光度(A)值較對(duì)照組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HLEC生長(zhǎng)速率明顯減慢,在12、24、36 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為19.6%、33.8%和24.2%。 2、PI3K抑制劑LY294002阻滯人晶狀體上皮細(xì)胞周期于G1／S期 FCM檢測(cè)得出：實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞數(shù)(66.15+2.63)%與對(duì)照組G1期細(xì)胞數(shù)(56.73+1.35)%相比增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞數(shù)(27.34+6.58)%較對(duì)照組S期細(xì)胞數(shù)(37.32+5.54)%顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、PI3K抑制劑LY294002抑制人晶狀體上皮細(xì)胞Skp2蛋白表達(dá) Western blot法檢測(cè)得出：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Skp2蛋白表達(dá)量明顯減少,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4、PI3K抑制劑LY294002抑制人晶狀體上皮細(xì)胞Skp2 mRNA表達(dá) 實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)得出：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Skp2 mRNA的表達(dá)量降低,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1、PI3K抑制劑LY294002抑制人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01／04的增殖。 2、LY294002抑制細(xì)胞中Skp2表達(dá),使部分細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G1／S期。
[Abstract]:Preface
Posterior capsular cataract is the most common complication after modern cataract surgery, which can cause the lower visual acuity, also called posterior capsular opacification (PCO). The residual lens epithelial cells (lens epithelial cells, LECs) after cataract surgery proliferate, migrate, fibrotic and accompany the secretion of extracellular matrix. It is the main reason for the formation of PCO, and the proliferation of lens epithelial cells is the most important. For many years, domestic and foreign scholars have been working on the study of inhibiting the proliferation of lens epithelial cells through drugs and other methods.
At present, signal transduction pathway is a hot spot in the research field of cell proliferation. PI3K/AKT (phosphati-dylinositol-3 kinase/AKT, phosphatidylinositol -3 kinase / protein kinase B) signaling pathway plays an important role in regulating cell growth, survival, proliferation and apoptosis, [3], and LY294002 as a specific inhibitor of this signal pathway can be inhibited. The proliferation of.S phase kinase related protein 2 (S phase kinase associated protein2, Skp2), as a target regulator in the downstream of the pathway, can mediate cell cycle factor degradation and regulate cell proliferation. This study applied PI3K inhibitor LY294002 to treat the cultured human crystalline epithelial cell lines in vitro, SRA01 / 04, to observe the proliferation of cells. The influence and research of possible mechanisms will provide a new theoretical basis for the prevention and treatment of posterior capsule opacification.
Materials and methods
First, material
Human lens epithelial cell line SRA01 / 04 was provided by the Institute of cancer research, Chinese Academy of Sciences, Beijing.
Two, method
1, cell culture, human lens epithelial cell line SRA01 / 04 was cultured in RPMI1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum, and placed at 37, 5%CO2, saturated humidity cell culture box.
2, the cells were grouped, the experimental group was added with 25 mol / L P13K inhibitor LY294002, and the control group was added equal volume DMSO..
3, the effect of PI3K inhibitor LY294002 on the proliferation of human lens epithelial cells was detected by MTT colorimetric assay, and the growth curve was plotted and the optimal time of LY294002 was screened.
4, flow cytometry (FCM) was used to detect the effect of PI3K inhibitor LY294002 on the cell cycle of human lens epithelial cells.
5, Western-blot method was used to detect the effect of PI3K inhibitor LY294002 on the expression of Skp2 protein in human lens epithelial cells.
6, real-time RT-PCR assay was used to detect the effect of PI3K inhibitor LY294002 on Skp2mRNA expression in human lens epithelial cells.
Three, statistical analysis
The experimental data were analyzed by SPSS 11.5 statistical software. The data of each group were expressed as x + s, and t analysis was used for statistical analysis. P0.05 showed that the difference was statistically significant.
Result
1, PI3K inhibitor LY294002 inhibits proliferation of human lens epithelial cells.
The MTT method showed that the absorbance (A) value of the experimental group was lower than that of the control group. The difference was statistically significant (P0.05), the growth rate of.HLEC was significantly slowed, and the growth inhibition rate of 12,24,36 h cells was 19.6%, 33.8% and 24.2%., respectively.
2, PI3K inhibitor LY294002 blocks human lens epithelial cell cycle in the G1 / S phase.
FCM detection showed that the number of cells in G1 phase (66.15+2.63) in the experimental group was more than that of the control group (56.73+1.35)%, and the difference was statistically significant (P0.05), while the number of S phase (27.34+6.58)% in the experimental group was significantly lower than that in the control group (37.32+5.54)%, and the difference was statistically significant (P0.05).
3, PI3K inhibitor LY294002 inhibits the expression of Skp2 protein in human lens epithelial cells.
Western blot assay showed that the expression of Skp2 protein in the experimental group was significantly decreased compared with that in the control group, and the difference was statistically significant (P0.05).
4, PI3K inhibitor LY294002 inhibits the expression of Skp2 mRNA in human lens epithelial cells.
Real time RT-PCR assay showed that the expression of Skp2 mRNA in experimental group decreased, and the difference was statistically significant compared with the control group (P0.05).
conclusion
1, PI3K inhibitor LY294002 inhibits the proliferation of human lens epithelial cell line SRA01 / 04.
2, LY294002 inhibited the expression of Skp2 in cells and blocked some cells in the G1 / S phase.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R776.1

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