【摘要】： 視覺神經(jīng)中成熟的神經(jīng)纖維和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的其他組成部分一樣,一旦受損將非常難以修復(fù)。成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)經(jīng)歷了損傷或視神經(jīng)眶內(nèi)損傷而發(fā)生凋亡后,無法再生。因此,如何延緩RGC的變性,并重新激活軸突再生程序,使它們能夠幸存下來并在受損的視神經(jīng)中再生出長(zhǎng)長(zhǎng)的的軸突一直是眼科及CNS研究領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn),眼內(nèi)活化的巨噬細(xì)胞對(duì)RGC具有顯著的促進(jìn)軸突再生效應(yīng)。而其中,由活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌的癌鈣調(diào)蛋白(oncomodulin,OM)是這一效應(yīng)的最重要的介導(dǎo)者。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在活體內(nèi),OM對(duì)損傷的成熟視神經(jīng)及周圍感覺神經(jīng)元也有促進(jìn)軸突再生作用。而OM發(fā)揮再生促進(jìn)效應(yīng)的確切機(jī)制尚不清楚。目前,國(guó)內(nèi)外均尚未有報(bào)道。對(duì)于OM的結(jié)構(gòu)和神經(jīng)再生功能方面的研究,目前國(guó)內(nèi)尚無報(bào)道。因此,對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究,可為神經(jīng)再生新途徑的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR從活化的大鼠巨噬細(xì)胞中獲得OM基因,構(gòu)建了pET22b(+)-OM原核表達(dá)載體并成功表達(dá)了OM,為進(jìn)一步完成對(duì)該蛋白的純化及對(duì)其活性研究與探討其促進(jìn)軸突再生的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 目的: 1.對(duì)大鼠癌鈣調(diào)蛋白(OM)進(jìn)行基因克隆,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并加以鑒定。 2. OM的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。 方法: 實(shí)驗(yàn)一:大鼠癌鈣調(diào)蛋白_OM基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 1.從SD大鼠腹腔中提取巨噬細(xì)胞培養(yǎng)活化,經(jīng)巨噬細(xì)胞特異性抗體CD68鑒定; 2.從活化的巨噬細(xì)胞中提取總RNA,利用相應(yīng)引物,通過RT-PCR的方法獲得OM基因序列,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定; 3.通過中間載體PUC57進(jìn)行目的基因克隆,將陽性克隆質(zhì)粒酶切,與原核表達(dá)載體PET-22b(+)連接,構(gòu)建PET-22b(+)-OM原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)菌檢PCR、DNA測(cè)序鑒定。 實(shí)驗(yàn)二:大鼠癌鈣調(diào)蛋白_OM基因原核表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)及鑒定 PET-22b(+)-OM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE觀察表達(dá)產(chǎn)物,Western-blot鑒定。 結(jié)果: 1. 1%瓊脂糖凝膠電泳獲得目的基因OM,大小為346bp左右,與設(shè)計(jì)的預(yù)期目的基因大小一致; 2.回收目的基因OM與中間載體PUC-57連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a,菌檢PCR獲得長(zhǎng)度500bp左右的陽性克隆,與預(yù)期大小完全一致。抽提質(zhì)粒PUC-57-OM,DNA測(cè)序鑒定證實(shí)與預(yù)期序列一致。 3.質(zhì)粒PUC-57-OM酶切后與載體PET-22b(+)連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a,抽提質(zhì)粒PET-22b(+)-OM,經(jīng)酶切鑒定及DNA測(cè)序后證實(shí)與預(yù)期序列一致。 4.重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-OM轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明目的蛋白OM主要以可溶形式存在于細(xì)菌裂解后的上清中,并經(jīng)過western blot鑒定確定為目的蛋白OM。 結(jié)論: 大鼠癌鈣調(diào)蛋白在原核細(xì)胞中成功表達(dá),為OM的獲得提供了一條切實(shí)可行的途徑。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,蛋白的活性研究及進(jìn)一步探討其促進(jìn)軸突再生的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , it has been found that in vivo and in vivo , OM plays an important role in promoting axonal regeneration .



Purpose :



1 . Cloning , constructing prokaryotic expression plasmid and identifying the gene of the rat ' s cancer calcineurin ( OM ) .



2.OM induced expression and identification .



Method :



Experiment 1 : Construction and Identification of Prokaryotic Expression Vector of Calcineurin _ OM Gene in Rats



1 . The activation of macrophages was extracted from the abdominal cavity of SD rats , and the macrophages - specific antibody CD68 was identified .



2 . extracting total RNA from activated macrophages , using corresponding primer , obtaining OM gene sequence through RT - PCR , 1 % agarose gel electrophoresis identification ;



3 . Using the intermediate vector PUC57 to clone the target gene , the positive cloning plasmid was digested and ligated with the prokaryotic expression vector PET - 22b ( + ) , and the prokaryotic expression plasmid of PET - 22b ( + ) - OM was constructed .



Experiment 2 : Expression and identification of prokaryotic expression vector of calcium - regulating protein _ OM gene of rat carcinoma in E . coli



The recombinant plasmid of PET - 22b ( + ) - OM was transformed into E . coli BL21 . The expression was induced by IPTG . The expression product was observed by SDS - PAGE and Western - blot .



Results :



1 . The target gene OM was obtained by 1 % agarose gel electrophoresis . The size of OM was about 346bp , which was consistent with the expected gene size of the designed gene .



2 . The recombinant plasmid PUC - 57 - OM was cloned into E . coli competent cell DH5a after being ligated with the intermediate vector PUC - 57 , and the positive clones with the length of 500 bp were obtained by PCR . The DNA sequencing and identification of PUC - 57 - OM were consistent with the expected sequence .



3 . The plasmid PUC - 57 - OM was digested with the vector PET - 22b ( + ) and transformed into E . coli competent cell DH5a . The plasmid PET - 22b ( + ) - OM was extracted and confirmed to be consistent with the expected sequence after digestion and DNA sequencing .



4 . The recombinant expression plasmid pET22b ( + ) - OM was transformed into BL21 and IPTG - induced protein expression .



Conclusion :



The successful expression of calcium - modulating protein in prokaryotic cells provided a feasible way for the acquisition of OM . For the subsequent experiments , the activity of protein was studied and the mechanism of promoting axonal regeneration was further explored .
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R774

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2133998