【摘要】：目的：研究嬰兒雙歧桿菌存在于鼻咽癌裸鼠模型的腫瘤組織靶向性。在此基礎(chǔ)上,進一步研究嬰兒雙歧桿菌在腫瘤組織乏氧區(qū)的靶向性分布。方法：插塊法建立鼻咽癌裸鼠模型,繼續(xù)喂養(yǎng)1-2周,選取瘤塊體積達到100mm3的荷瘤鼠隨機分成實驗組和對照組,每組各8只。實驗組荷瘤鼠尾靜脈注射嬰兒雙歧桿菌懸液(每只總菌量約為3×106-6×106cfu)0.2ml,對照組荷瘤鼠每只注射無菌PBS 0.2ml。第7天處死動物,并于處死前40min給予腹腔注射氫氧化哌莫硝唑(pimonidazole hydrochloride, HP-1)60mg/kg；頸椎脫臼法處死動物后,按無菌操作原則分別取肝、肺、腎、脾、心和腫瘤組織,并將腫瘤和脾臟各自均剖為兩半,分別放置于福爾馬林液固定和研磨缸中勻漿混合平板培養(yǎng),其余器官組織直接在研磨缸中勻漿后混合平板培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)72h后可見部分平板上有乳白色、呈水樣半透明、直徑大小不等一般為1-2mm、邊緣整齊的菌落生長,對混合平板培養(yǎng)的菌落計數(shù),并根據(jù)公式：細菌總數(shù)(cfu/g)=同一稀釋度平均菌落數(shù)(cfu)/涂布平板所用的稀釋液體積(ml)×稀釋倍數(shù)計算出各樣本的細菌總數(shù)(cfu/g),以了解厭氧菌在實驗組和對照組的定植生長情況,以及實驗組厭氧菌在腫瘤及其他正常組織器官的蓄積生長情況。此外,對福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤和脾臟組織,切片經(jīng)免疫熒光染色后置于熒光顯微鏡下觀察、照相,在同一視野下對三種熒光燃料(FITC、Cy3、DAPI)特異性染色的切片分別用不同的激發(fā)光(紅光、藍光、紫外光)激發(fā)得到相應(yīng)的圖像。使用羊抗兔Cy3熒光二抗(紅色)共軛兔抗嬰兒雙岐桿菌抗體顯示組織內(nèi)嬰兒雙岐桿菌,用羊抗鼠IgG FITC熒光二抗(綠色)共軛小鼠IgG抗乏氧探針抗體顯示組織內(nèi)乏氧細胞區(qū)域,用DAPI熒光染料(藍色)顯示組織內(nèi)所有細胞胞核。由此,乏氧探針染色區(qū)域(綠色)指示腫瘤乏氧區(qū)；DAPI染色區(qū)域(藍色)為腫瘤內(nèi)所有細胞結(jié)構(gòu)完整區(qū)胞核所在,腫瘤切片上DAPI染色缺失區(qū)域(無色)即為壞死區(qū)(細胞結(jié)構(gòu)已破壞,核不著色)；而不在上述缺氧區(qū)、壞死區(qū)且DAPI胞核染色正常(藍色)的區(qū)域即為富氧區(qū)。在我們的重合圖中,嬰兒雙歧桿菌在乏氧區(qū)的分布為二者染色的重合(紅色+綠色=黃色),在壞死區(qū)的分布為紅色(紅色+DAPI染色缺失=紅色),在富氧區(qū)的分布為品紅色(紅色+藍色=品紅色)；采用IPP圖像分析軟件分析圖像,分別計算出嬰兒雙歧桿菌在腫瘤組織乏氧區(qū)、壞死區(qū)和足氧區(qū)的分布比例,并用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,以了解嬰兒雙歧桿菌瘤內(nèi)分布的特點。結(jié)果：(1)組織勻漿厭氧培養(yǎng)后行菌落計數(shù),發(fā)現(xiàn)未注射嬰兒雙歧桿菌的荷瘤鼠(對照組),無論是腫瘤組織還是肝、心、肺、脾、腎等正常組織的勻漿培養(yǎng)均未見厭氧菌生長；而注射了嬰兒雙歧桿菌的荷瘤鼠(實驗組),分別對其腫瘤組織和肝、心、肺、脾、腎等正常組織的勻漿厭氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：嬰兒雙歧桿菌主要聚集生長于腫瘤組織,而在肝、心、肺、脾、腎等正常組織器官幾乎未見蓄積,腫瘤組織中嬰兒雙歧桿菌的分布數(shù)值均數(shù)±標準差(x±s)為5086.25±2238.46 cfu/g(2.07×103-9.47×103cfu/g),正常組織器官中嬰兒雙歧桿菌的分布數(shù)值(x±s)為16.75±47.38 cfu/g (0-0.134×103cfu/g)。腫瘤與正常組織菌量之比超過300-500：1,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.508,P0.05)；實驗全程未發(fā)現(xiàn)受試裸鼠不適體征及安全事件。(2)組織切片的免疫熒光染色后,通過定量分析嬰兒雙歧桿菌在瘤內(nèi)各區(qū)域的分布面積比例顯示：嬰兒雙歧桿菌在腫瘤乏氧區(qū)的分布比例(0.6901±0.2137)明顯高于其在壞死區(qū)(0.2994±0.2112)或富氧區(qū)(0.0105±0.0136)的分布比例(兩兩比較q檢驗分別q=9.1315,q=5.2557,均為P0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義；嬰兒雙歧桿菌在壞死區(qū)的分布比例(0.2994±0.2112)明顯高于其在富氧區(qū)的分布比例(0.0105±0.0136)(兩兩比較q檢驗q=3.8758,P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：在鼻咽癌裸鼠模型中,正常組織器官幾乎未見嬰兒雙歧桿菌蓄積,該菌主要聚集生長于腫瘤組織,嬰兒雙歧桿菌對腫瘤組織具有良好的靶向分布能力,在腫瘤組織中其主要分布于腫瘤乏氧區(qū)。雙岐桿菌沒有致病性又能在腫瘤乏氧區(qū)中選擇性定植的特點,使其具有基因治療的載體系統(tǒng)的天然優(yōu)勢,具有良好的作為腫瘤基因治療的載體的前景。
[Abstract]:Objective : To study the targeting of Bifidobacterium in nude mice model of nasopharyngeal carcinoma .
The total number of bacteria ( cfu / g ) of each sample was determined by immunofluorescence staining , and the total bacterial count ( cfu / g ) was observed under the same field of view .
The DAPI staining area ( blue ) is the nucleus of all cell structures in the tumor , and the DAPI staining loss area ( colorless ) on the tumor section is the necrotic area ( the cell structure has been damaged and the nucleus is not colored ) ;
The distribution of Bifidobacterium in the oxygen - rich region is red ( red + DAPI staining is missing = red ) , and the distribution in the oxygen - rich region is magenta ( red + blue = magenta ) .
The distribution ratio of Bifidobacterium in tumor tissue , necrotic area and foot oxygen area was calculated by using the IPP image analysis software . The data were analyzed by SPSS 13.0 software to understand the characteristics of the distribution of Bifidobacterium . Results : ( 1 ) No growth of anaerobe was found in the homogenate culture of normal tissues such as tumor tissue or liver , heart , lung , spleen and kidney .
The distribution values ( x 鹵 s ) were 16.75 鹵 47.38 cfu / g ( 2.07 脳 103 - 9.47 脳 103 cfu / g ) and 16.75 鹵 47.38 cfu / g ( 0 - 0.134 脳 103 cfu / g ) respectively .
( 2 ) The distribution ratio of Bifidobacterium in tumor - free zone ( 0.6901 鹵 0.2137 ) was significantly higher than that in the necrotic area ( 0.2994 鹵 0.2137 ) or oxygen - enriched area ( 0.0105 鹵 0.0136 ) .
Conclusion : In the nude mice model of nasopharyngeal carcinoma , there is little accumulation of Bifidobacterium in normal tissues , which mainly focuses on tumor tissues .
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

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本文編號：2133987