本文選題：Roundabout4(Robo4) + 小干擾RNA�。� 參考：《吉林大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：血-視網(wǎng)膜屏障是存在于血液和視網(wǎng)膜之間具有限制性通透性的結(jié)構(gòu)，對(duì)維護(hù)視網(wǎng)膜組織微環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。血-視網(wǎng)膜屏障包括內(nèi)屏障和外屏障。血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障主要由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成，血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮屏障功能障礙導(dǎo)致血管滲漏是糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、Coats病等疾病發(fā)生的主要病理改變之一，也是許多視網(wǎng)膜血管性疾病視力損害的重要原因。因此，探索內(nèi)皮屏障功能損害發(fā)生機(jī)理具有十分重要的臨床意義。 血管內(nèi)皮通透性增高可能有兩種機(jī)制，一種是細(xì)胞內(nèi)路徑（transcellular pathway），另一種是細(xì)胞旁路徑（paracellular pathway）。細(xì)胞旁路徑是內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增高的主要途徑，內(nèi)皮細(xì)胞間廣泛的緊密連接（tight junction, TJ）是細(xì)胞旁路徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。多項(xiàng)研究表明，occludin和ZO-1是兩個(gè)關(guān)鍵的緊密連接蛋白。TJ蛋白表達(dá)量的變化、在細(xì)胞內(nèi)的位置分布變化和／或結(jié)構(gòu)功能的異常均可能破壞TJ的完整性，引起細(xì)胞間連接的開放，導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增高。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞骨架，特別是肌動(dòng)蛋白（actin）的重組和再分布也是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮、血管通透性增高的主要病理基礎(chǔ)。 Robo家族(Roundabout family)是一類與發(fā)育有關(guān)的保守跨膜蛋白家族，目前已知其對(duì)神經(jīng)軸突延伸和神經(jīng)細(xì)胞遷移有重要的調(diào)控作用。新近發(fā)現(xiàn)的Robo4，是Robo家族的第四個(gè)成員，又稱為MRB (magic roundabout)，是一種保守跨膜受體蛋白。Robo4與其他Robo蛋白質(zhì)不同，只特異性表達(dá)于血管新生活躍的內(nèi)皮細(xì)胞表面，并參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。最近有文獻(xiàn)報(bào)道Robo4可以阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）下游的信號(hào)途徑而抑制病理性新生血管的發(fā)生，同時(shí)在缺氧視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，Robo4可以明顯降低視網(wǎng)膜血管的滲漏性。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Robo4可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，維持成熟血管系統(tǒng)的穩(wěn)定，但關(guān)于Robo4在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性的確切作用機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。 通過觀察Robo4對(duì)緊密連接蛋白及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白actin的影響，探討Robo4對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控作用，并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行深入探討。研究分為三部分。首先，在應(yīng)用糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end product, AGE）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加的過程中檢測(cè)Robo4蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：隨著AGE濃度的增加，Robo4蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，呈劑量依賴性；隨著AGE作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Robo4蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，呈時(shí)間依賴性，表明內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加的過程中伴隨著Robo4蛋白表達(dá)的減少，提示Robo4蛋白可能在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控過程中發(fā)揮作用；為進(jìn)一步證實(shí)Robo4對(duì)視網(wǎng)膜通透性的調(diào)控作用，應(yīng)用Robo4小干擾RNA特定沉默Robo4的表達(dá)，通過測(cè)定葡聚糖的熒光發(fā)射強(qiáng)度評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的變化，結(jié)果表明：干擾抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中Robo4的表達(dá)水平，會(huì)使內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。 由于緊密連接相關(guān)蛋白與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白之間的相互作用在維持緊密連接的完整性方面具有重要作用，推測(cè)在抑制Robo4表達(dá)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性的過程中，可能伴隨著細(xì)胞間緊密連接的開放，Robo4可能通過改變緊密連接從而發(fā)揮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)作用。在第二部分研究中，應(yīng)用western blot檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：干擾抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中Robo4蛋白的表達(dá)，可相應(yīng)降低細(xì)胞中occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)水平；同時(shí)應(yīng)用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量彌散分布的應(yīng)力纖維，而分布在細(xì)胞周邊的外周致密束則明顯減少，表明靶向敲除Robo4基因的表達(dá)可以促使緊密連接開放，從而導(dǎo)致體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加，其緊密連接的開放可能與緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1的表達(dá)減少及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的重組和再分布密切相關(guān)，初步闡明Robo4調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞通透性的機(jī)制。 F-actin的組裝和去組裝受到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多種蛋白的調(diào)節(jié)，稱為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)了100多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其中肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白（actindepolymerizing factor/cofilin, ADF/cofilin）被認(rèn)為有著關(guān)鍵作用，是近年來研究的熱點(diǎn)。在第三部分研究中，應(yīng)用western blot和siRNA共轉(zhuǎn)染技術(shù)，闡明LIM激酶（LIM kinase,LIMK）-cofilin信號(hào)途徑參與了Robo4對(duì)緊密連接的調(diào)控過程，進(jìn)一步揭示Robo4調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性的機(jī)制。結(jié)果顯示：干涉Robo4后磷酸化cofilin（phosphorylatedcofilin, p-cofilin）和LIMK1的蛋白表達(dá)明顯增加，為了進(jìn)一步證實(shí)該信號(hào)途徑，通過構(gòu)建LIMK1siRNA、共轉(zhuǎn)染Robo4siRNA和LIMK1siRNA后發(fā)現(xiàn)， p-cofilin的表達(dá)隨之降低，同時(shí)伴隨緊密連接蛋白的表達(dá)增加和應(yīng)力纖維的減少，并且視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的通透性也得到恢復(fù)，說明LIMK1-cofilin信號(hào)途徑參與了Robo4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控過程。 綜上所述，Robo4在內(nèi)皮細(xì)胞通透性方面起到重要作用，靶向干涉Robo4的表達(dá)增加了體外培養(yǎng)的單層視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性，，Robo4通過改變緊密連接從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性進(jìn)行調(diào)節(jié)，緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)下調(diào)和細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin的重排是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加的直接原因，LIMK1-cofilin信號(hào)途徑參與了Robo4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控過程。
[Abstract]:Blood - retinal barrier is a kind of structure with restrictive permeability between blood and retina . The blood - retinal barrier includes inner barrier and outer barrier . Blood - retinal barrier consists of inner barrier and outer barrier . Blood - retinal barrier consists of inner barrier and outer barrier . Vascular endothelial cell is one of the main pathological changes in diabetic retinopathy , retinopathy of premature infants and Coats disease .

The increase in vascular endothelial permeability may have two mechanisms , one is the intracellular pathway and the other is the pathway pathway . It is found that the recombination and redistribution of the endothelial cells , especially actin , is the main pathological basis for the contraction of endothelial cells and the increase of vascular permeability .

Robo4 is the fourth member of Robo family and is a conserved transmembrane receptor protein . Robo4 , which is a fourth member of Robo family , is a conservative transmembrane receptor protein . Robo4 is a conservative transmembrane receptor protein . Robo4 is a conserved transmembrane receptor protein . Robo4 can block vascular endothelial growth factor ( VEGF ) downstream signaling pathway and participate in the regulation of endothelial cell migration . Recently , the literature report Robo4 can block vascular endothelial growth factor ( VEGF ) permeability , maintain the stability of mature vascular system , but the exact mechanism of Robo4 in retinal endothelial cell permeability has not been reported .

By observing the effects of Robo4 on the actin of closely linked protein and cytoskeletal actin , the mechanism of Robo4 in retinal endothelial cell permeability was discussed . The possible mechanism was discussed . First , the expression of Robo4 protein was detected in the course of increased permeability of endothelial cells induced by advanced advanced end product ( AGE ) .
The expression of Robo4 protein decreased with the increase of AGE action time , which showed that Robo4 protein could play a role in the regulation of permeability of retinal endothelial cells .
In order to further confirm the effect of Robo4 on retinal permeability , Robo4 siRNA specific silencing Robo4 expression was used to evaluate the change of monolayer permeability of retinal vascular endothelial cells by measuring the fluorescence emission intensity of dextran . The results showed that the inhibition of Robo4 expression in retinal vascular endothelial cells could increase the permeability of endothelial cells and destroy the barrier function of endothelial cells .

In the second part of the study , the expression of Robo4 protein in the endothelial cells of retinal vascular endothelial cells was inhibited by western blot .
At the same time , the cell skeleton actin F - actin in the cells was stained by rhodamine - ghost cyclopeptide , and there appeared a large number of dispersed stress fibers in the cytoplasm , while the peripheral dense bundles distributed around the periphery of the cells decreased significantly , which indicated that the monolayer permeability of the targeted knock - out Robo4 gene was increased , and the opening of the close connection could be closely related to the expression of the closely linked proteins , the expression of ZO - 1 and the recombination and redistribution of the cytoskeletal actin , and the mechanism of Robo4 regulating the permeability of endothelial cells was preliminarily clarified .

In the third part , we found that the expression of phosphorylation cofilin ( LIMK ) - cofilin ( ADF / cofilin ) and LIMK1 increased significantly in the third part . The results showed that the expression of phosphorylation cofilin ( LIMK ) - cofilin ( ADF / cofilin ) and LIMK1 increased significantly in the third part . The results showed that the expression of phosphorylation cofilin ( LIMK ) - cofilin and LIMK1 in Robo4 decreased , while the permeability of the retinal endothelial cells was restored . The expression of LIMK1 - cofilin signal was involved in the regulation of the permeability of Robo4 to endothelial cells .

In conclusion , Robo4 plays an important role in the permeability of endothelial cells , and the expression of targeted interference Robo4 increases the permeability of monolayer retinal endothelial cells cultured in vitro . Robo4 regulates the permeability of endothelial cells by changing the tight junctions , and the downregulation of the associated protein kinase din and ZO - 1 and the rearrangement of actin F - actin are the direct causes of increased permeability of endothelial cells .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R774.1

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本文編號(hào)：2056533