發(fā)布時間：2018-06-23 08:39

  本文選題：Roundabout4(Robo4) + 小干擾RNA　； 參考：《吉林大學》2013年博士論文

【摘要】：血-視網(wǎng)膜屏障是存在于血液和視網(wǎng)膜之間具有限制性通透性的結(jié)構(gòu)，對維護視網(wǎng)膜組織微環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。血-視網(wǎng)膜屏障包括內(nèi)屏障和外屏障。血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障主要由視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞及細胞間的緊密連接構(gòu)成，血管內(nèi)皮細胞是內(nèi)屏障的結(jié)構(gòu)基礎。血管內(nèi)皮屏障功能障礙導致血管滲漏是糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、Coats病等疾病發(fā)生的主要病理改變之一，也是許多視網(wǎng)膜血管性疾病視力損害的重要原因。因此，探索內(nèi)皮屏障功能損害發(fā)生機理具有十分重要的臨床意義。 血管內(nèi)皮通透性增高可能有兩種機制，一種是細胞內(nèi)路徑（transcellular pathway），另一種是細胞旁路徑（paracellular pathway）。細胞旁路徑是內(nèi)皮細胞滲透性增高的主要途徑，內(nèi)皮細胞間廣泛的緊密連接（tight junction, TJ）是細胞旁路徑的結(jié)構(gòu)基礎。多項研究表明，occludin和ZO-1是兩個關(guān)鍵的緊密連接蛋白。TJ蛋白表達量的變化、在細胞內(nèi)的位置分布變化和／或結(jié)構(gòu)功能的異常均可能破壞TJ的完整性，引起細胞間連接的開放，導致血管內(nèi)皮通透性增高。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞骨架，特別是肌動蛋白（actin）的重組和再分布也是導致內(nèi)皮細胞收縮、血管通透性增高的主要病理基礎。 Robo家族(Roundabout family)是一類與發(fā)育有關(guān)的保守跨膜蛋白家族，目前已知其對神經(jīng)軸突延伸和神經(jīng)細胞遷移有重要的調(diào)控作用。新近發(fā)現(xiàn)的Robo4，是Robo家族的第四個成員，又稱為MRB (magic roundabout)，是一種保守跨膜受體蛋白。Robo4與其他Robo蛋白質(zhì)不同，只特異性表達于血管新生活躍的內(nèi)皮細胞表面，并參與調(diào)控內(nèi)皮細胞的遷移。最近有文獻報道Robo4可以阻斷血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）下游的信號途徑而抑制病理性新生血管的發(fā)生，同時在缺氧視網(wǎng)膜病變動物模型中發(fā)現(xiàn)，Robo4可以明顯降低視網(wǎng)膜血管的滲漏性。多數(shù)學者認為Robo4可以降低內(nèi)皮細胞的通透性，維持成熟血管系統(tǒng)的穩(wěn)定，但關(guān)于Robo4在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞通透性的確切作用機制尚未見相關(guān)報道。 通過觀察Robo4對緊密連接蛋白及細胞骨架肌動蛋白actin的影響，探討Robo4對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)控作用，并對可能的機制進行深入探討。研究分為三部分。首先，在應用糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end product, AGE）誘導內(nèi)皮細胞通透性增加的過程中檢測Robo4蛋白的表達變化，結(jié)果顯示：隨著AGE濃度的增加，Robo4蛋白的表達呈下降趨勢，呈劑量依賴性；隨著AGE作用時間的延長，Robo4蛋白的表達呈下降趨勢，呈時間依賴性，表明內(nèi)皮細胞通透性增加的過程中伴隨著Robo4蛋白表達的減少，提示Robo4蛋白可能在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)控過程中發(fā)揮作用；為進一步證實Robo4對視網(wǎng)膜通透性的調(diào)控作用，應用Robo4小干擾RNA特定沉默Robo4的表達，通過測定葡聚糖的熒光發(fā)射強度評價視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞單層通透性的變化，結(jié)果表明：干擾抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中Robo4的表達水平，會使內(nèi)皮細胞的通透性增加，破壞內(nèi)皮細胞的屏障功能。 由于緊密連接相關(guān)蛋白與細胞骨架肌動蛋白之間的相互作用在維持緊密連接的完整性方面具有重要作用，推測在抑制Robo4表達增加內(nèi)皮細胞通透性的過程中，可能伴隨著細胞間緊密連接的開放，Robo4可能通過改變緊密連接從而發(fā)揮對內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)節(jié)作用。在第二部分研究中，應用western blot檢測緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達變化，結(jié)果顯示：干擾抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中Robo4蛋白的表達，可相應降低細胞中occludin和ZO-1蛋白的表達水平；同時應用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對細胞內(nèi)的細胞骨架肌動蛋白F-actin進行染色發(fā)現(xiàn)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量彌散分布的應力纖維，而分布在細胞周邊的外周致密束則明顯減少，表明靶向敲除Robo4基因的表達可以促使緊密連接開放，從而導致體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞單層通透性增加，其緊密連接的開放可能與緊密連接相關(guān)蛋白occludin、ZO-1的表達減少及細胞骨架肌動蛋白的重組和再分布密切相關(guān)，初步闡明Robo4調(diào)控內(nèi)皮細胞通透性的機制。 F-actin的組裝和去組裝受到細胞質(zhì)內(nèi)多種蛋白的調(diào)節(jié)，稱為肌動蛋白結(jié)合蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)了100多種肌動蛋白結(jié)合蛋白，其中肌動蛋白解聚因子/絲切蛋白（actindepolymerizing factor/cofilin, ADF/cofilin）被認為有著關(guān)鍵作用，是近年來研究的熱點。在第三部分研究中，應用western blot和siRNA共轉(zhuǎn)染技術(shù)，闡明LIM激酶（LIM kinase,LIMK）-cofilin信號途徑參與了Robo4對緊密連接的調(diào)控過程，進一步揭示Robo4調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞通透性的機制。結(jié)果顯示：干涉Robo4后磷酸化cofilin（phosphorylatedcofilin, p-cofilin）和LIMK1的蛋白表達明顯增加，為了進一步證實該信號途徑，通過構(gòu)建LIMK1siRNA、共轉(zhuǎn)染Robo4siRNA和LIMK1siRNA后發(fā)現(xiàn)， p-cofilin的表達隨之降低，同時伴隨緊密連接蛋白的表達增加和應力纖維的減少，并且視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的通透性也得到恢復，說明LIMK1-cofilin信號途徑參與了Robo4對內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)控過程。 綜上所述，Robo4在內(nèi)皮細胞通透性方面起到重要作用，靶向干涉Robo4的表達增加了體外培養(yǎng)的單層視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞通透性，，Robo4通過改變緊密連接從而對內(nèi)皮細胞通透性進行調(diào)節(jié)，緊密連接相關(guān)蛋白occludin和ZO-1的表達下調(diào)和細胞骨架肌動蛋白F-actin的重排是導致內(nèi)皮細胞通透性增加的直接原因，LIMK1-cofilin信號途徑參與了Robo4對內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)控過程。
[Abstract]:Blood - retinal barrier is a kind of structure with restrictive permeability between blood and retina . The blood - retinal barrier includes inner barrier and outer barrier . Blood - retinal barrier consists of inner barrier and outer barrier . Blood - retinal barrier consists of inner barrier and outer barrier . Vascular endothelial cell is one of the main pathological changes in diabetic retinopathy , retinopathy of premature infants and Coats disease .

The increase in vascular endothelial permeability may have two mechanisms , one is the intracellular pathway and the other is the pathway pathway . It is found that the recombination and redistribution of the endothelial cells , especially actin , is the main pathological basis for the contraction of endothelial cells and the increase of vascular permeability .

Robo4 is the fourth member of Robo family and is a conserved transmembrane receptor protein . Robo4 , which is a fourth member of Robo family , is a conservative transmembrane receptor protein . Robo4 is a conservative transmembrane receptor protein . Robo4 is a conserved transmembrane receptor protein . Robo4 can block vascular endothelial growth factor ( VEGF ) downstream signaling pathway and participate in the regulation of endothelial cell migration . Recently , the literature report Robo4 can block vascular endothelial growth factor ( VEGF ) permeability , maintain the stability of mature vascular system , but the exact mechanism of Robo4 in retinal endothelial cell permeability has not been reported .

By observing the effects of Robo4 on the actin of closely linked protein and cytoskeletal actin , the mechanism of Robo4 in retinal endothelial cell permeability was discussed . The possible mechanism was discussed . First , the expression of Robo4 protein was detected in the course of increased permeability of endothelial cells induced by advanced advanced end product ( AGE ) .
The expression of Robo4 protein decreased with the increase of AGE action time , which showed that Robo4 protein could play a role in the regulation of permeability of retinal endothelial cells .
In order to further confirm the effect of Robo4 on retinal permeability , Robo4 siRNA specific silencing Robo4 expression was used to evaluate the change of monolayer permeability of retinal vascular endothelial cells by measuring the fluorescence emission intensity of dextran . The results showed that the inhibition of Robo4 expression in retinal vascular endothelial cells could increase the permeability of endothelial cells and destroy the barrier function of endothelial cells .

In the second part of the study , the expression of Robo4 protein in the endothelial cells of retinal vascular endothelial cells was inhibited by western blot .
At the same time , the cell skeleton actin F - actin in the cells was stained by rhodamine - ghost cyclopeptide , and there appeared a large number of dispersed stress fibers in the cytoplasm , while the peripheral dense bundles distributed around the periphery of the cells decreased significantly , which indicated that the monolayer permeability of the targeted knock - out Robo4 gene was increased , and the opening of the close connection could be closely related to the expression of the closely linked proteins , the expression of ZO - 1 and the recombination and redistribution of the cytoskeletal actin , and the mechanism of Robo4 regulating the permeability of endothelial cells was preliminarily clarified .

In the third part , we found that the expression of phosphorylation cofilin ( LIMK ) - cofilin ( ADF / cofilin ) and LIMK1 increased significantly in the third part . The results showed that the expression of phosphorylation cofilin ( LIMK ) - cofilin ( ADF / cofilin ) and LIMK1 increased significantly in the third part . The results showed that the expression of phosphorylation cofilin ( LIMK ) - cofilin and LIMK1 in Robo4 decreased , while the permeability of the retinal endothelial cells was restored . The expression of LIMK1 - cofilin signal was involved in the regulation of the permeability of Robo4 to endothelial cells .

In conclusion , Robo4 plays an important role in the permeability of endothelial cells , and the expression of targeted interference Robo4 increases the permeability of monolayer retinal endothelial cells cultured in vitro . Robo4 regulates the permeability of endothelial cells by changing the tight junctions , and the downregulation of the associated protein kinase din and ZO - 1 and the rearrangement of actin F - actin are the direct causes of increased permeability of endothelial cells .
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1

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本文編號：2056533