本文選題：單皰病毒性角膜炎 + 基質(zhì)金屬蛋白酶　； 參考：《武漢大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一部分實(shí)驗(yàn)性小鼠單純皰疹角膜炎中基質(zhì)金屬蛋白酶及粘著斑激酶的表達(dá) 目的：探討I型單純皰疹病毒(]herpes simplex virus-1,HSV-1)感染Ba1B/c小鼠眼角膜所致的基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2, MMP-2)及粘著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)表達(dá)的變化。方法：雌性BALB/c小鼠40只隨機(jī)分為4組,每組10只,每只均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。搔刮角膜上皮后點(diǎn)滴1型單純皰疹病毒(HSV-1)誘發(fā)單純皰疹性角膜炎(HSK)。裂隙燈下每日觀察小鼠角膜變化并分別于感染后第0,2,7,14天處死小鼠,每組取5只小鼠的感染眼球行石蠟包埋,并應(yīng)用抗MMP-2,抗FAK的多克隆抗體免疫染色角膜切片,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP-2及FAK表達(dá)。收集每組另5只小鼠的感染角膜,抽提角膜組織中總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳,采用計(jì)算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)提取圖像并分析電泳條帶灰度值。采用方差分析SNK-q檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果：感染后小鼠均可見典型的單純皰疹性角膜炎表現(xiàn),裂隙燈下觀察感染后第2天見樹枝狀上皮缺損,繼而發(fā)生淺層基質(zhì)炎癥,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),第7天后角膜基質(zhì)水腫,基質(zhì)浸潤(rùn),潰瘍形成及新生血管形成,至第14天逐步加重。免疫組化顯示感染后第2天,MMP-2及FAK的表達(dá)比未感染眼增加且表達(dá)主要位于淺表基質(zhì)層及上皮下的炎性細(xì)胞中。感染后第7天,MMP-2及FAK的表達(dá)較第2天減弱。而感染后第14天可見角膜基質(zhì)中及浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中尤其是潰瘍處可見MMP-2及FAK的表達(dá)再次顯著增加�？傮w來看HSK模型的角膜上皮細(xì)胞排列紊亂,基質(zhì)水腫,中性粒細(xì)胞增多,MMP-2及FAK陽性細(xì)胞數(shù)增多,同陰性對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示MMP-2,FAKmRNA的表達(dá)大體上隨感染天數(shù)增加呈增高的趨勢(shì)。其中MMP-2mRNA的表達(dá)在感染后第0天與第2天差異沒有顯著性(P0.05),感染后第7,14天mRNA的表達(dá)逐漸增高差異有顯著性意義(P0.01)。FAKmRNA的表達(dá)在感染后第0天,第2天,第7天逐漸增高,第14天表達(dá)達(dá)到最高值,但其中第7天較第2天的增高差異沒有顯著性(P0.05),其余各組差異均有顯著性意義(P0.01)。 結(jié)論：HSV-1感染角膜后,中性粒細(xì)胞與角膜細(xì)胞釋放大量的蛋白水解酶MMP-2,并且在實(shí)驗(yàn)性小鼠HSK動(dòng)物模型中檢測(cè)到了FAK在角膜上皮細(xì)胞中大量表達(dá),其表達(dá)趨勢(shì)隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)呈階梯向上的波形,推測(cè)二者在角膜上皮炎、角膜潰瘍穿孔、新生血管形成等過程中發(fā)揮重要作用。 第二部分HSV-1感染對(duì)人角膜上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶及粘著斑激酶的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究 目的：探討I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染對(duì)體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞MMP-2和FAK表達(dá)的影響。 方法：采用組織塊培養(yǎng)法(組織塊來自穿透性角膜移植術(shù)后剩余供體角膜)行人角膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及細(xì)胞傳代。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞行生物學(xué)性狀的鑒定,包括倒置顯微鏡的觀察和免疫組織化學(xué)染色鑒定。取2-4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以HSV-1(F株)感染體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞(human corneal epithelial cell, HCE), Lipofectamine介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)染,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)法、免疫印跡法、免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法分別于2h、20h、40h檢測(cè)HCE基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2,MMP-2)和粘著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)表達(dá)情況。結(jié)果：感染后2h、20h、40h, MMP-2和FAKmRNA表達(dá)分別同非感染細(xì)胞相比顯著增強(qiáng)(P0.01,P0.05)；感染后2h MMP-2、YAK、P-FAK蛋白表達(dá)同非感染細(xì)胞相比無顯著差別(p0.05)；感染后20h、40h、MMP-2、FAK、P-FAK蛋白表達(dá)同非感染細(xì)胞相比差別顯著(p0.05) 結(jié)論：在HSV-1感染的早期,磷酸化的FAK在病毒入侵細(xì)胞和MMP-2的激活過程中起著重要作用。FAK參與了MMPs的表達(dá)和激活,同時(shí)FAK蛋白自身激活后可促進(jìn)MMPs的表達(dá)和活性增加,FAK激活MMP-2的具體通路有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Expression of matrix metalloproteinases and focal adhesion kinase in experimental mice with herpes simplex keratitis

Objective : To investigate the changes of matrix metallo - 2 ( MMP - 2 ) and focal adhesion kinase ( focal adhesion kinase ) expression induced by herpes simplex virus - 1 ( HSV - 1 ) infection in mice . Methods : 40 female BALB / c mice were randomly divided into 4 groups .

Results : After infection , the expression of MMP - 2 , MMP - 2 was significantly higher than that in the negative control group ( P0.05 ) .

Conclusion : After infection with HSV - 1 , neutrophils and corneal cells release a large amount of proteolytic enzyme MMP - 2 , and the expression of focal adhesion kinase in corneal epithelial cells was detected in experimental mice .

Study on the expression of matrix metalloproteinases and focal adhesion kinase in human corneal epithelial cells by HSV - 1 infection

Objective : To investigate the effect of herpes simplex virus - 1 ( HSV - 1 ) infection on the expression of MMP - 2 in human corneal epithelial cells in vitro .

Methods : The expression of matrix metallo - 2 , matrix metallo - 2 , MMP - 2 and focal adhesion kinase in cultured human corneal epithelial cells ( HCE ) were detected by polymerase chain reaction ( PCR ) , Western blotting , immunohistochemistry and immunofluorescence . The results showed that the expression of MMP - 2 and FAKmRNA in cultured human corneal epithelial cells ( HCE ) , MMP - 2 and MMP - 2 were significantly increased at 2h , 20 h , 40 h after infection ( P0.01 , P0.05 ) .
The expression of MMP - 2 , YAK and P - C protein in 2 hours post - infection was not significantly different from that of non - infected cells ( p < 0.05 ) .
Compared with non - infected cells ( p < 0.05 ) , the expression of MMP - 2 , focal adhesion kinase and the protein in the infected cells were significantly higher than those of non - infected cells ( P < 0.05 ) .

Conclusion : In the early stage of HSV - 1 infection , the phosphorylation of focal adhesion kinase plays an important role in the activation of the virus invading cells and MMP - 2 .
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R772.21

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2029505