本文選題：單皰病毒性角膜炎 + 基質金屬蛋白酶�。� 參考：《武漢大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分實驗性小鼠單純皰疹角膜炎中基質金屬蛋白酶及粘著斑激酶的表達 目的：探討I型單純皰疹病毒(]herpes simplex virus-1,HSV-1)感染Ba1B/c小鼠眼角膜所致的基質金屬蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2, MMP-2)及粘著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)表達的變化。方法：雌性BALB/c小鼠40只隨機分為4組,每組10只,每只均取右眼為實驗眼。搔刮角膜上皮后點滴1型單純皰疹病毒(HSV-1)誘發(fā)單純皰疹性角膜炎(HSK)。裂隙燈下每日觀察小鼠角膜變化并分別于感染后第0,2,7,14天處死小鼠,每組取5只小鼠的感染眼球行石蠟包埋,并應用抗MMP-2,抗FAK的多克隆抗體免疫染色角膜切片,應用免疫組織化學法檢測MMP-2及FAK表達。收集每組另5只小鼠的感染角膜,抽提角膜組織中總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA后進行PCR擴增,擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳,采用計算機凝膠成像系統提取圖像并分析電泳條帶灰度值。采用方差分析SNK-q檢驗對實驗數據進行半定量分析。 結果：感染后小鼠均可見典型的單純皰疹性角膜炎表現,裂隙燈下觀察感染后第2天見樹枝狀上皮缺損,繼而發(fā)生淺層基質炎癥,炎性細胞浸潤,第7天后角膜基質水腫,基質浸潤,潰瘍形成及新生血管形成,至第14天逐步加重。免疫組化顯示感染后第2天,MMP-2及FAK的表達比未感染眼增加且表達主要位于淺表基質層及上皮下的炎性細胞中。感染后第7天,MMP-2及FAK的表達較第2天減弱。而感染后第14天可見角膜基質中及浸潤的炎性細胞中尤其是潰瘍處可見MMP-2及FAK的表達再次顯著增加�？傮w來看HSK模型的角膜上皮細胞排列紊亂,基質水腫,中性粒細胞增多,MMP-2及FAK陽性細胞數增多,同陰性對照組相比差異具有統計學意義(P0.05)。RT-PCR結果顯示MMP-2,FAKmRNA的表達大體上隨感染天數增加呈增高的趨勢。其中MMP-2mRNA的表達在感染后第0天與第2天差異沒有顯著性(P0.05),感染后第7,14天mRNA的表達逐漸增高差異有顯著性意義(P0.01)。FAKmRNA的表達在感染后第0天,第2天,第7天逐漸增高,第14天表達達到最高值,但其中第7天較第2天的增高差異沒有顯著性(P0.05),其余各組差異均有顯著性意義(P0.01)。 結論：HSV-1感染角膜后,中性粒細胞與角膜細胞釋放大量的蛋白水解酶MMP-2,并且在實驗性小鼠HSK動物模型中檢測到了FAK在角膜上皮細胞中大量表達,其表達趨勢隨感染時間的延長呈階梯向上的波形,推測二者在角膜上皮炎、角膜潰瘍穿孔、新生血管形成等過程中發(fā)揮重要作用。 第二部分HSV-1感染對人角膜上皮細胞中基質金屬蛋白酶及粘著斑激酶的表達及調節(jié)機制的研究 目的：探討I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染對體外培養(yǎng)人角膜上皮細胞MMP-2和FAK表達的影響。 方法：采用組織塊培養(yǎng)法(組織塊來自穿透性角膜移植術后剩余供體角膜)行人角膜上皮細胞原代培養(yǎng)及細胞傳代。對培養(yǎng)細胞行生物學性狀的鑒定,包括倒置顯微鏡的觀察和免疫組織化學染色鑒定。取2-4代細胞進行實驗。以HSV-1(F株)感染體外培養(yǎng)人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cell, HCE), Lipofectamine介導法基因轉染,應用聚合酶鏈反應法、免疫印跡法、免疫組織化學法、免疫熒光法分別于2h、20h、40h檢測HCE基質金屬蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2,MMP-2)和粘著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)表達情況。結果：感染后2h、20h、40h, MMP-2和FAKmRNA表達分別同非感染細胞相比顯著增強(P0.01,P0.05)；感染后2h MMP-2、YAK、P-FAK蛋白表達同非感染細胞相比無顯著差別(p0.05)；感染后20h、40h、MMP-2、FAK、P-FAK蛋白表達同非感染細胞相比差別顯著(p0.05) 結論：在HSV-1感染的早期,磷酸化的FAK在病毒入侵細胞和MMP-2的激活過程中起著重要作用。FAK參與了MMPs的表達和激活,同時FAK蛋白自身激活后可促進MMPs的表達和活性增加,FAK激活MMP-2的具體通路有待進一步研究。
[Abstract]:Expression of matrix metalloproteinases and focal adhesion kinase in experimental mice with herpes simplex keratitis

Objective : To investigate the changes of matrix metallo - 2 ( MMP - 2 ) and focal adhesion kinase ( focal adhesion kinase ) expression induced by herpes simplex virus - 1 ( HSV - 1 ) infection in mice . Methods : 40 female BALB / c mice were randomly divided into 4 groups .

Results : After infection , the expression of MMP - 2 , MMP - 2 was significantly higher than that in the negative control group ( P0.05 ) .

Conclusion : After infection with HSV - 1 , neutrophils and corneal cells release a large amount of proteolytic enzyme MMP - 2 , and the expression of focal adhesion kinase in corneal epithelial cells was detected in experimental mice .

Study on the expression of matrix metalloproteinases and focal adhesion kinase in human corneal epithelial cells by HSV - 1 infection

Objective : To investigate the effect of herpes simplex virus - 1 ( HSV - 1 ) infection on the expression of MMP - 2 in human corneal epithelial cells in vitro .

Methods : The expression of matrix metallo - 2 , matrix metallo - 2 , MMP - 2 and focal adhesion kinase in cultured human corneal epithelial cells ( HCE ) were detected by polymerase chain reaction ( PCR ) , Western blotting , immunohistochemistry and immunofluorescence . The results showed that the expression of MMP - 2 and FAKmRNA in cultured human corneal epithelial cells ( HCE ) , MMP - 2 and MMP - 2 were significantly increased at 2h , 20 h , 40 h after infection ( P0.01 , P0.05 ) .
The expression of MMP - 2 , YAK and P - C protein in 2 hours post - infection was not significantly different from that of non - infected cells ( p < 0.05 ) .
Compared with non - infected cells ( p < 0.05 ) , the expression of MMP - 2 , focal adhesion kinase and the protein in the infected cells were significantly higher than those of non - infected cells ( P < 0.05 ) .

Conclusion : In the early stage of HSV - 1 infection , the phosphorylation of focal adhesion kinase plays an important role in the activation of the virus invading cells and MMP - 2 .
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R772.21

【共引文獻】

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本文編號：2029505