本文選題：樹突狀細胞 + 細胞因子誘導的殺傷細胞�。� 參考：《新鄉(xiāng)醫(yī)學院》2013年碩士論文

【摘要】：目的： 本實驗通過分離健康人外周血單個核細胞,應用不同的細胞因子體外誘導分化出樹突狀細胞(Dendritic Cells, DC)和細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine-induced killer cells, CIK)細胞,將凍融抗原(Antigen, Ag)致敏DC并與CIK細胞共培養(yǎng)。 (1)觀察視網(wǎng)膜母細胞瘤(Retinoblasotma, RB)細胞株RB-Y79細胞凍融抗原致敏的DC與CIK細胞共培養(yǎng)后,DC與CIK細胞的形態(tài)學改變、細胞表型以及細胞增殖情況的變化； (2)探討凍融抗原致敏的DC-CIK細胞(DC-Ag-CIK細胞)對RB-Y79細胞的殺傷作用以及聯(lián)合應用卡鉑后對RB-Y79細胞的協(xié)同殺傷作用。 (3)探討DC-Ag-CIK細胞聯(lián)合卡鉑對RB-Y79細胞可能的殺傷機制。 方法： (1)觀察凍融抗原致敏的DC與CIK細胞的體外增殖與生物學活性。取健康人外周血單個核細胞,加入不同細胞因子培養(yǎng)DC及CIK細胞,第3天用RB-Y79細胞凍融抗原致敏DC并于第7天將DC與CIK共培養(yǎng),分為CIK組, DC-CIK組和DC-Ag-CIK組。第7天倒置顯微鏡下觀察DC及CIK細胞形態(tài),以及3組細胞在共培養(yǎng)后的增殖情況。流式細胞儀檢測DC第3、7天及CIK細胞第7、15天的細胞表型變化。CBA細胞因子試劑盒檢測共培養(yǎng)至第15天時3組細胞上清液中IL-6及IL-10的含量。 (2)檢測殺瘤活性。PI法檢測卡鉑對RB-Y79及hTERT-RPE1細胞的殺傷活性；CFSE/PI法檢測效應細胞(CIK、DC-CIK及DC-Ag-CIK細胞)在不同效靶比下對RB-Y79細胞、hTERT-RPE1細胞(正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞)、RB耐藥細胞(RB-resistant cells, RB-R)的殺傷作用,以及效應細胞聯(lián)合卡鉑對RB-Y79細胞的殺傷作用和CIK細胞在不同培養(yǎng)液條件下對RB-Y79細胞的殺傷活性; CFSE/PI法檢測卡鉑與DC-Ag-CIK細胞在不同應用順序下對RB-Y79細胞的殺傷作用。 (3)在RB-Y79細胞上轉(zhuǎn)染GFP綠色熒光蛋白并篩選出RB-GFP細胞,免疫熒光顯微鏡拍攝卡鉑和／或DC-Ag-CIK細胞對RB-GFP細胞的動態(tài)殺瘤過程；免疫熒光染色法及流式細胞術檢測卡鉑和／或DC-Ag-CIK細胞作用RB細胞后,RB細胞膜外Annexin V蛋白的表達情況。 結果： (1)經(jīng)過培養(yǎng)的DC呈現(xiàn)出典型的“樹突狀”結構,CIK細胞則聚集成團。培養(yǎng)至第15天時,DC-Ag-CIK和DC-CIK組的細胞數(shù)絕對值明顯高于CIK組(P0.01),DC-CIK組與DC-Ag-CIK組的IL-6含量明顯高于CIK組,而DC-Ag-CIK組IL-10含量明顯低于CIK組與DC-CIK組(P0.01)。經(jīng)過7天的培養(yǎng),DC細胞表型CD80、CD83、CD86的表達率均明顯高于第3天時的DC細胞(P0.01)。第15天的各組CIK細胞的細胞表型均明顯高于第7天未與DC共培養(yǎng)時的CIK細胞(P0.01),而在第15天的CIK組、DC-CIK組及Ag-DC-CIK組中,Ag-DC-CIK組的CD3+CD56+及CD3+CD8+表達率均明顯高于CIK組及DC-CIK組(P0.01)。 (2)效應細胞隨著效靶比的增高對RB-Y79細胞的殺傷活性也隨之增高,在相同效靶比下,Ag-DC-CIK細胞對RB-Y79細胞的殺傷活性明顯高于CIK組與DC-CIK組(P0.05)；效應細胞對正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞hTERT-RPE1細胞幾乎沒有殺傷作用,且各組效應細胞之間沒有明顯差異(P0.05)；CIK細胞在三種不同培養(yǎng)液條件下對RB-Y79細胞的殺傷活性無明顯差異(P0.05)；在效應細胞與卡鉑聯(lián)合作用后,在相同效靶比的條件下對RB-Y79細胞的殺傷活性明顯高于單獨應用效應細胞和單獨應用卡鉑(P0.01),同時對RB耐藥細胞的殺傷活性也明顯高于單獨應用效應細胞(P0.01)；在兩次卡鉑中加入應用DC-Ag-CIK細胞后,其殺瘤率高(71.16±4.65%),與其他各組相比具有非常顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01)。 (3)當RB-GFP細胞死亡時,RB細胞的綠色熒光消失,同時變被PI染成紅色。RB細胞預先與卡鉑共培養(yǎng)12小時后再加入DC-Ag-CIK細胞,其出現(xiàn)RB凋亡細胞比單獨應用卡鉑及單獨應用DC-Ag-CIK細胞需較短的時間；DC-Ag-CIK組Annexin V陽性細胞表達率明顯高于CIK組及DC-CIK組(P0.01),與CIK細胞組相比,DC-Ag-CIK細胞能引發(fā)更多的RB凋亡細胞(P0.01),卡鉑聯(lián)合DC-Ag-CIK細胞后,其引發(fā)RB凋亡細胞數(shù)明顯多于DC-Ag-CIK組及單獨卡鉑組(P0.01)。 結論： (1)RB凍融抗原致敏的DC與CIK細胞共培養(yǎng)后,可促進DC及CIK細胞的成熟與分化,使CIK細胞具有更強的增殖活性,并與IL-6的分泌上調(diào)以及IL-10的分泌下調(diào)有關。 (2)RB凍融抗原致敏的DC可增強CIK細胞對RB-Y79細胞的特異性殺傷作用,可能由于DC-Ag與CIK細胞共培養(yǎng)后可使CIK細胞大量增殖并誘導出大量CD3+CD56+的T細胞,從而提高了殺瘤活性。而DC-Ag-CIK細胞對正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞(hTERT-RPE1細胞)無明顯殺傷作用。 (3)效應細胞聯(lián)合卡鉑后對RB-Y79細胞及RB-R細胞均可產(chǎn)生明顯的協(xié)同殺傷作用,DC-Ag-CIK細胞聯(lián)合低劑量的卡鉑對RB-Y79細胞仍可產(chǎn)生明顯的殺瘤效果。 (4)卡鉑聯(lián)合DC-Ag-CIK細胞后能縮短殺瘤時間,其殺瘤機制可能是通過增加誘導RB細胞出現(xiàn)早期凋亡。
[Abstract]:Objective:
In this experiment, the human peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy human peripheral blood, and different cytokines were used to induce Dendritic Cells (DC) and cytokine induced killer cells (Cytokine-induced killer cells, CIK) cells, and to sensitized DC with freeze-thaw antigen (Antigen, Ag) and co culture with CIK cells.
(1) to observe the morphological changes of DC and CIK cells, the changes of cell phenotype and cell proliferation after the co culture of DC and CIK cells sensitized by the freeze-thaw antigen of Retinoblasotma (RB) cell line RB-Y79 cells.
(2) to investigate the killing effect of DC-CIK cells (DC-Ag-CIK cells) sensitized by freeze-thaw antigen on RB-Y79 cells and the synergistic killing effect of combined application of carboplatin on RB-Y79 cells.
(3) to explore the possible killing mechanism of DC-Ag-CIK cells combined with carboplatin on RB-Y79 cells.
Method錛，

本文編號：2018915