本文選題：腫瘤干細(xì)胞 + 上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：研究背景 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤,好發(fā)于中國(guó)華南地區(qū),每100,000人大約有25-50人發(fā)病。盡管目前治療鼻咽癌的治療手段多樣化,但是鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了治療的失敗和病人的死亡。目前有大量的證據(jù)表明,腫瘤細(xì)胞中存在著小部分維持著腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的群體,這些細(xì)胞具有自我分裂和分化的能力。因此這部分細(xì)胞通常也被考慮為維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的根源所在,通常人們把它們命名為腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSCs)或者干細(xì)胞樣(Stem Cell-like)腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤干細(xì)胞是腫瘤的“本源”,因此尋找出腫瘤干細(xì)胞的靶點(diǎn)和針對(duì)靶點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行干預(yù)是治療腫瘤比較具有建設(shè)性的策略。 有文章報(bào)導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和腫瘤干細(xì)胞有聯(lián)系,上皮向間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化通常表現(xiàn)為：細(xì)胞間的粘附減弱；細(xì)胞的形態(tài)從上皮的多邊形向間充質(zhì)的梭型轉(zhuǎn)化；同時(shí)伴有上皮標(biāo)志物E-鈣(E-cadherin)的表達(dá)缺失和間充質(zhì)標(biāo)志物Vimenti, snail等的表達(dá)上調(diào)。越來越多的證據(jù)表明EMT是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移的先發(fā)條件。而腫瘤干細(xì)胞通常兼并著EMT的屬性。 而原癌基因MYC作為經(jīng)典的癌基因,已經(jīng)在很多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了MYC的高表達(dá),同時(shí)也被證實(shí)在腫瘤干細(xì)胞的維持上和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。但是MYC調(diào)控EMT和腫瘤干細(xì)胞的分子機(jī)理目前還不清楚。然而,我們的研究中發(fā)現(xiàn),MYC在鼻咽癌中進(jìn)行過表達(dá)可以增加腫瘤細(xì)胞中側(cè)群(Sidepopulation)的比例和腫瘤球的形成能力以此同時(shí),MYC也可以增加腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果表明了,MYC可能在鼻咽癌中同樣可以影響腫瘤細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移能力。 小分子非編碼RNA (MicroRNAs)通常具有22個(gè)堿基的長(zhǎng)度,可以通過靶向結(jié)合基因的3’端非編碼區(qū)域?qū)崿F(xiàn)對(duì)其的調(diào)控作用。小分子非編碼RNA可以通過調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞以及EMT功能相關(guān)基因從而對(duì)腫瘤干細(xì)胞和EMT發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。已經(jīng)證實(shí)miR-200c可以靶向Bmil和SUZ12調(diào)控EMT和腫瘤干細(xì)胞,Bmil的過表達(dá)可以過表達(dá)EMT調(diào)節(jié)通路中的重要基因ZEB1, ZEB1可以通過抑制E-Cadherin,同時(shí)過表達(dá)Vimentin實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT的調(diào)控。因此由上可見,miR-200c在對(duì)腫瘤干細(xì)胞和EMT的調(diào)節(jié)中起著重要作用。 經(jīng)典的抑癌基因P53可以通過綁定miR-200c的5’端的啟動(dòng)子區(qū)域,促進(jìn)miR-200c的表達(dá),抑制腫瘤干細(xì)胞和EMT的發(fā)生。P53和miR-200c在人體腫瘤組織中呈正相關(guān)的關(guān)系并且P53和miR-200c的低表達(dá),病人的預(yù)后差,表達(dá)增加則預(yù)后好。我們的通過使用生物信息學(xué)(http://www. biobase-international.com/gene-regulation)的方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-200c的5’端同樣具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄子MYC的靶向結(jié)合位點(diǎn)。這樣的發(fā)現(xiàn),我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中證實(shí)了MYC可以通過靶向結(jié)合miR-200c的啟動(dòng)子區(qū)域抑制其表達(dá)。由于MYC的過表達(dá)可以抑制miR-200c增加腫瘤細(xì)胞的干性(stemness),我們假設(shè)抑制MYC可以抑制腫瘤細(xì)胞的干性和EMT的特性,而腫瘤干細(xì)胞是腫瘤耐藥的根本所在,因此抑制MYC可能可以增加腫瘤組織對(duì)藥物的敏感性。 由于腫瘤組織中存在著腫瘤干細(xì)胞,并且腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤起源和維持細(xì)胞生長(zhǎng)的根源。以此同時(shí)腫瘤干細(xì)胞具有藥物耐受的特點(diǎn),因此有人提出,要治愈腫瘤必須要?dú)缒[瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞。在這樣的背景下,我們提出和實(shí)施了以下科研策略,通過靶向調(diào)控MYC而過表達(dá)miR-200c降低腫瘤細(xì)胞的干性,從而增加抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤組織,細(xì)胞的殺傷作用。 研究目的 1.明確MYC的表達(dá)對(duì)干細(xì)胞的影響。 2.在鼻咽癌中驗(yàn)證miR-200c對(duì)腫瘤干細(xì)胞以及EMT的調(diào)節(jié)作用。 3.驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子MYC通過靶向作用miR-200c的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)ζ鋵?shí)行調(diào)節(jié)作用。 4.探討MYC對(duì)miR-200c的調(diào)控作用是否影響了鼻咽癌的干細(xì)胞的富集以及EMT。 5.研究MYC對(duì)miR-200c的調(diào)控作用是否對(duì)傳統(tǒng)化療藥有協(xié)助作用。 方法 細(xì)胞和培養(yǎng)條件： 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。人鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,293T細(xì)胞使用含有10%的DMEM培養(yǎng)基,所有的培養(yǎng)基中每200m1均含有青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 腫瘤球培養(yǎng)和分化實(shí)驗(yàn)： 無血清培養(yǎng)基配制：無血清培養(yǎng)基(serum free medium, SFM)由Ham's DMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)組成,將鼻咽癌SUNE-1,5-8F細(xì)胞接種于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗兩次,細(xì)胞計(jì)數(shù)后置于低粘附培養(yǎng)板中,懸浮于SFM中進(jìn)行傳代培養(yǎng),觀察細(xì)胞在SFM中形成腫瘤干細(xì)胞球的過程,將于SFM中形成的細(xì)胞球重新置于SSM中誘導(dǎo)其分化,48h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 載體和核酸小分子片段的轉(zhuǎn)染： Both pLKO.1lentiviral shRNA vector and control shRNA targeting 所有的pLKO.1慢病毒干擾載體和針對(duì)GFP的對(duì)照干擾載體均購(gòu)買自Aldrich-Sigma。在慢病毒shc-Mycl中的MYC干擾載體的靶向序列是：CCTGAGACAGATCAGCAACAA.在慢病毒shc-Myc2中的MYC干擾載體的靶向序列是：CAGTTGAAACACAAACTTGAA。c-Myc的過表達(dá)載體是來自美國(guó)Fox Chase腫瘤中心。慢病毒載體miR-200c惠贈(zèng)自Michael F. Clarke (Stanford大學(xué))。miR-200a小分子核酸模擬物,miR-200b小分子核酸模擬物,miR-200c小分子核酸模擬物and miR-200c的核酸抑制劑購(gòu)買自Genepharma公司(中國(guó),上海)。用來做啟動(dòng)子分析的miR-200c的啟動(dòng)子區(qū)域克隆自人的染色體組然后通過使用酶切位點(diǎn)KpnI和NheI接入空白載體pGL4(Promega). miR-200c的熒光素酶載體突變使用的是QuikChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒(Stratagene)所有的載體的序列見附表1。所有的載體的轉(zhuǎn)染均使用Lipofectamine2000(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)候,使用產(chǎn)生的病毒感染目的細(xì)胞,感染48小時(shí)候收集細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。 免疫熒光： 吸取SFM中形成的腫瘤球至24孔板中(腫瘤球樣品),或吸取SFM中形成的腫瘤球植入預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中(腫瘤球分化樣品),4%多聚甲醛固定,PBS清洗,0.2%Triton X-100破膜,PBS清洗,加入一抗37℃孵育45min,PBS清洗,洗滌后加入熒光二抗,37℃孵育45min, PBS清洗,DAPI染細(xì)胞核,在共聚焦顯微鏡下觀察。10×KB配方：0.1M Tris, pH7.5;1.5M NaCl;1.0%BSA。 MTT檢測(cè)： 過濾網(wǎng)將大于40tμm的腫瘤球分離出來分離成單個(gè)細(xì)胞或?qū)?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞分別接種到96孔板中,每孔2000個(gè)細(xì)胞,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h,依濃度梯度加入藥物。藥物作用完畢后每孔加20μl MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4-5h,將細(xì)胞培養(yǎng)液上清棄去,每孔加入200μl DMSO,搖床混勻約5min。酶標(biāo)儀490nm比色,繪制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 總蛋白的提取使用的是RIPA試劑(Sigma-Aldrich),提取的蛋白置入SDS-PAGE電泳膠中,轉(zhuǎn)膜使用的是PVDF纖維膜(Millipore),轉(zhuǎn)膜后封閉于含有05%脫脂奶粉的TBS+0.05%Tween-2封閉液中.沒個(gè)膠中均含有蛋白失蹤顯示標(biāo)記液；封閉后一抗四度過夜,一抗孵育完成后用PBS洗4次*5分鐘。二抗孵育一個(gè)小時(shí)用PBS漂洗4次*5分鐘后用顯影液顯影。生物發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)拍照。以下為我們實(shí)驗(yàn)中使用的蛋白及來源：c-Myc, Suz-12, Bmi-1, Sox2, E-cadherin, Zeb2, Vimentin, GAPDH (Santa-Cruz Biotechnology). 側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)： 將經(jīng)過處理后的貼壁細(xì)胞消化并重懸為單個(gè)細(xì)胞,離心后用PBS清洗,含2%胎牛血清的1640培基重懸,用Hoechst33342標(biāo)記,沒1*10的五次方細(xì)胞加入Hoechst33342lug標(biāo)記的細(xì)胞在37℃孵育90min, PBS洗滌,重懸,檢測(cè)前加入Propidium Iodide標(biāo)記死細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群比例。 RNA提�。� 細(xì)胞總RNA提�。杭�(xì)胞消化,離心,棄上清,加入1ml Trizol;室溫孵育15min,裂解細(xì)胞；4℃,12000rpm離心15min,取上清；每1ml Trizol加入0.2m1氯仿,劇烈振蕩15s,冰上孵育15min;4℃,12000rpm離心15min,緩慢取上清,避免吸入中間層的白色物質(zhì),上層水相體積約為所用Trizol試劑的60%；將吸取的上清置于另一干凈EP管內(nèi),加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA,顛倒混勻,40C, 12000rpm離心15min,見RNA沉淀附著于EP管底和側(cè)壁；棄上清,用預(yù)冷的75%乙醇(1%DEPC水配制)lml懸浮洗滌沉淀；4℃,7500g離心5min,干燥RNA,用DEPC水溶解沉淀,-80℃保存。 免疫組織化學(xué)： 石蠟切片經(jīng)脫蠟,乙醇梯度水化,抗原修復(fù),滅活內(nèi)源性過氧化物酶,一抗4℃孵育過夜,二抗25℃孵育10min, DAB顯色,顯微鏡觀察顯色,蘇木素復(fù)染核,鹽酸乙醇分化,脫水,透明。 克隆形成實(shí)驗(yàn) 對(duì)照載體和c-Myc, miR-200c過表達(dá)慢病毒載體感染的鼻咽癌細(xì)胞經(jīng)過計(jì)數(shù)后每個(gè)6孔板中滴入200個(gè)細(xì)胞。使用1640常規(guī)培養(yǎng)12小時(shí)或者過夜以后加入藥物Cisplatin, Taxol和Adriamycin繼續(xù)培養(yǎng)16天。再長(zhǎng)得比較多的孔的克隆數(shù)大于50個(gè)是,終止培養(yǎng),細(xì)胞固定并染色拍照。 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 對(duì)照載體和c-Myc, miR-200c過表達(dá)慢病毒載體感染的鼻咽癌細(xì)胞經(jīng)過計(jì)消化后用RPMT重懸待用。為了分析細(xì)胞的侵襲能力。每個(gè)8μM大小的纖維生物薄膜中滴入1*105細(xì)胞上室使用的是無血清培養(yǎng)基,下室使用的是含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37度培養(yǎng)18小時(shí)候細(xì)胞用10%的甲醛固定并染色。沒有遷移過纖維膜的細(xì)胞用棉花拭去,20倍顯微鏡(Nikon Eclipse80i)下觀察多視野拍照并統(tǒng)計(jì)。 動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中我們嚴(yán)格執(zhí)行了動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)的規(guī)定和南方醫(yī)科大學(xué)的動(dòng)物試驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行操作。6周齡的裸鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué),每個(gè)老鼠皮下臀部注入1*105的處理后的鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞接種后每5天測(cè)量一次大小。瘤體的大小計(jì)算公式為：V(mm3)=(a×b2)/2,其中a代表的是瘤體的長(zhǎng)距,b代表的是寬距。當(dāng)腫瘤達(dá)到70mmm3的大小時(shí)老鼠隨機(jī)分成4組,每組的老鼠為3個(gè)。miR-200c的使用量是50ng/g,而cisplatin的用量是2μg/g Cisplatin處理了四個(gè)周期分別在開始處理后的第6,11,16,21天,周末停藥,miR-200c使用了6個(gè)周期,每三天一次處理分別在第6,9,12,15,18,21天,所有的瘤體的大小均在處理后的24小時(shí)內(nèi)測(cè)量。 熒光素酶分析 處理后的細(xì)胞分別培養(yǎng)與24孔板或者48孔板中。熒光素酶使用的是Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega),并按照實(shí)驗(yàn)說明書操作。在轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)候細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移至96孔板中加入Glo-Max Luminometer (Promega)上機(jī)檢測(cè)。 本課題所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；腫瘤球形成及直徑,ALDH陽(yáng)性細(xì)胞和側(cè)群比例,凋亡檢測(cè),動(dòng)物成瘤時(shí)間以及原代細(xì)胞腫瘤球數(shù)量數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法；如方差不齊,采用Welch值,多重比較采用Dunnett T3法；在體腫瘤生長(zhǎng)曲線的比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較各組間差異。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 1. c-Myc和miR-200c在鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞以及腫瘤球中的表達(dá)負(fù)相關(guān)。 (1) miR-200a, miR-200b, miR-200c在鼻咽癌細(xì)胞側(cè)群中表達(dá)下調(diào),而c-Myc表達(dá)上調(diào),c-Myc和miR-200c家族的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 (2)在鼻咽癌細(xì)胞株CNE1, CNE2中過表達(dá)c-Myc均發(fā)現(xiàn)側(cè)群的比例增加。 (3)腫瘤過表達(dá)c-Myc以后也增加了腫瘤球的成瘤比例。 2. c-Myc可以在轉(zhuǎn)錄水平直接靶向調(diào)節(jié)miR-200c. (1)通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)在miR-200c的5’端啟動(dòng)子區(qū)域存在著四個(gè)c-Myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)。 (2)在鼻咽癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)入含有miR-200c5'端啟動(dòng)子區(qū)域的luc載體,然后在進(jìn)行c-Myc的過表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-Myc后細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。 (3)對(duì)miR-200c的啟動(dòng)子上的c-Myc結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變以后發(fā)現(xiàn)c-Myc的調(diào)控減弱或者消失。 (4)干擾或者過表達(dá)c-Myc后對(duì)miR-200c的表達(dá)產(chǎn)生了影響。 3. miR-200c可以調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞株的干性。 (1)在鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中過表達(dá)miR-200c發(fā)現(xiàn)和腫瘤干細(xì)胞干性先關(guān)的因子：SUZ12, BMI1, SOX2表達(dá)下調(diào)。 (2)過表達(dá)miR-200c可以引起鼻咽癌側(cè)群比例下降。 (3)過表達(dá)miR-200c可以引起腫瘤球的形成比例下降。 (4)免疫熒光結(jié)果顯示過表達(dá)miR-200c可以引起SUZ12, BMI1, SOX2的核表達(dá)下降。 4. c-Myc對(duì)鼻癌細(xì)胞干性的影響是通過對(duì)miR-200c的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。 (1)EMT也是腫瘤細(xì)胞干性的指標(biāo)之一,過表達(dá)miR-200c可以抑制c-Myc誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的EMT的發(fā)生。 (2) c-Myc通過miR-200c調(diào)控下游的SUZ12, BMI1, Vimentin, E-cad等和腫瘤細(xì)胞干性相關(guān)的基因。 (3) c-Myc的過表可以增加鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力。 (4) c-Myc對(duì)側(cè)群細(xì)胞的調(diào)節(jié)是通過對(duì)miR-200c的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。 5.非干細(xì)胞殺傷的腫瘤藥物可以增加腫瘤干細(xì)胞的富集,并且可以引起miR-200c的表達(dá)下調(diào),c-Myc的表達(dá)上調(diào)。 (1)非干細(xì)胞殺傷腫瘤藥物并不能殺死腫瘤干細(xì)胞,可以引起腫瘤干細(xì)胞的富集。 (2)干細(xì)胞殺傷腫瘤藥物同時(shí)也可以引起腫瘤球的形成比例增加。 (3)干細(xì)胞殺傷腫瘤藥物以此同時(shí)miR-200c的表達(dá)下降。 (4)MYC,和Vimentin的表達(dá)增加,E-cad的表達(dá)下降。 6.在鼻咽癌細(xì)胞株中過表達(dá)miR-200c或者抑制MYC均可以增加鼻咽癌細(xì)胞株對(duì)化療的敏感性。 (1)順鉑,肽素以及阿莫西林對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有一定的殺傷作用。 (2)過表達(dá)miR-200c后可以增加順鉑,肽素以及阿莫西林對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷。 (3)或者抑制MYC均可以增加鼻咽癌細(xì)胞株對(duì)順鉑,肽素以及阿莫西林的敏感性。 7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),對(duì)miR-200c的過表達(dá)可以增加非干細(xì)胞殺傷化療藥物的敏感性。 (1)在裸鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)通常使用miR-200c和順鉑可以殺傷抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 (2)聯(lián)合使用miR-200c和順鉑可以增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和瘤體的抑制作用。 (3)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-200c和順鉑聯(lián)合可以抑制腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的蛋白的表達(dá)。 (4)側(cè)群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了miR-200c和順鉑聯(lián)合使用可以抑制腫瘤組織中的側(cè)群比例。 結(jié)論： 1.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在鼻咽癌中MYC可以通過靶向調(diào)節(jié)miR-200c/ZEB2通路調(diào)節(jié)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的干性。 2.在鼻咽癌中使用傳統(tǒng)化療藥物并不能殺滅腫瘤干細(xì)胞,并且使腫瘤細(xì)胞群體中的側(cè)群比例增加,干性增強(qiáng)。 3.靶向作用抑制MYC的表達(dá)或者增加miR-200c的表達(dá)可以降低鼻咽癌細(xì)胞中的干性,同時(shí)增加化療藥物對(duì)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 George A. Calin;;Principles of microRNA involvement in human cancers[J];癌癥;2011年11期

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本文編號(hào)：2016110